ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ, ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАЧЕСТВА, РАЗБАВЛЕНИЯ И ХРАНЕНИЯ СПЕРМЫ

Получение спермы. Это первый и весьма важный технический прием, используемый при искусственном осеменении животных. От того, насколько правильно получена сперма, будет зависеть успех максимального использования племенных производителей.

При разработке техники и выборе метода получения спермы следует учитывать, что они должны отвечать следующим основным требования:

  • 1) позволять получать эякулят без потерь;
  • 2) не снижать количества и жизнеспособности спермиев;
  • 3) гарантировать защиту производителей от травм и особенно от инфекционных заболеваний;
  • 4) быть простыми технически, выполняемыми в производственных условиях без сложного оборудования;
  • 5) обеспечивать стерильность получения спермы.

При разработке техники искусственного осеменения сельскохозяйственных животных было предложено много методов получения спермы от производителей: влагалищный и губочный методы, методы спермособирателя и массажа внутренних половых органов, фистульный и электрический методы, метод искусственной вагины. Наиболее эффективным оказался метод искусственной вагины, который широко используется в настоящее время. Использование искусственной вагины по сравнению с другими методами позволяет получать от самцов наиболее чистую и высококачественную сперму для искусственного осеменения животных.

Искусственная вагина состоит из двухстенного цилиндра (рис. 9.1). Наружный цилиндр эбонитовый, резиновый или металлический, внутренний — эластичная гладкая резиновая камера (трубка), надетая на наружный цилиндр. На наружном цилиндре имеются патрубки (один или два) для наливания в межстенную полость цилиндра теплой воды и нагнетания воздуха. На одном из концов цилиндра искусственной вагины закрепляются спермоприемники.

Эякуляция в искусственную вагину происходит при определенной температуре. У быков рефлекс эякуляции проявляется при температуре 40—50°С; более низкие и высокие температуры резко тормозят эякуляцию. Для барана температурные колебания, при которых эякуляция происходит без торможения, находятся в пределах

Искусственная вагина для жеребца

Рис. 9.1. Искусственная вагина для жеребца:

  • 1 — цилиндр; 2 — патрубок с трубкой; 3 — горловина; 4 — спермоприемник
  • 40—65°С. Наиболее интенсивно эякуляция у баранов происходит при температурах 45—55°С. У хряков и жеребцов сперму можно получить при температуре вагины 40—47°С, но лучшие результаты получаются при 43—45°С. Однако получение спермы при высоких температурах ухудшает ее качество из-за перегревания спермиев.

Оптимальная температура для обеспечения нормального проявления рефлекса эякуляции и получения спермы хорошего качества у всех самцов — 40—42°С.

Большое значение имеет давление, создаваемое в вагине. От его силы зависят рефлекс эякуляции, определенные объем спермы и количество спермиев. Обычно слабое давление тормозит рефлекс эякуляции или вызывает его задержку — асперматизм. Сперма при этом совсем не извергается в искусственную вагину, а выделяется после окончания полового акта. Сильное давление также тормозит рефлекс эякуляции, а чаще всего приводит к механическому аспер-матизму в результате сильного сжатия мочеиспускательного канала. Оптимальным для рефлекса эякуляции у быка, барана и хряка является давление 40 мм рт. ст.

Укороченная искусственная вагина для быка с одноразовым спермо-приемником из полиэтиленовой пленки имеет цилиндр длиной 30 см. Наружный цилиндр упругий, резиновый. Внутреннюю резиновую камеру надевают на цилиндр с обоих концов и закрепляют тремя резиновыми кольцами. На середине цилиндра имеется воронкообразный патрубок с отверстием для заливания воды. В отверстие патрубка вставляют эбонитовый кран. По всей окружности с одного его края просверлено 6—8 отверстий диаметром 8 мм для компенсации избыточного давления внутри вагины в момент эякуляции за счет выхода части воды в межстенное пространство между цилиндром и резиновой камерой (рис. 9.2).

Для предотвращения травмы пениса быка о жесткий край цилиндра при садке целесообразно входное отверстие цилиндра вагины закрыть манжетом из губчатой резины или поролона толщиной 1,5—2,0 см, общей длиной 10—12 см и длиной по наружному диаметру 22 см.

/

Конструкции искусственной вагины для быка

Рис. 9.2. Конструкции искусственной вагины для быка:

о — образец 1942 г.; б — образец И.И. Родина; в — датская; г — английская: 1 — спермоприемник; 2 — цилиндр; 3 — камера; 4 — резиновые кольца; 5 — баллонообразное расширение; б — резиновая трубка; 7 — стеклянный спермоприемник

Искусственная вагина с баллонообразным расширением для хряка состоит из алюминиевого цилиндра размером 250 х 65 мм, расширенной части цилиндра размером 160 х 136 мм, малого цилиндра размером 60 х 68 мм, горлышка для заливания воды, закрываемого резиновой пробкой, внутренней резиновой трубки и спермоприем-ника (рис. 9.3).

Искусственные вагины для хряков

Рис. 9.3. Искусственные вагины для хряков:

а — электрическая; б — водоналивная: 7 — термометр; 2 — отверстие для заливки воды; 3 — трубка для накачивания воздуха; 4 — кожух; 5 — резиновая камера; б — электросвеча; в — спермоприемник к искусственной вагине: 7 — колпак; 2 — фильтр; 3 — стакан; 4 — резиновая трубка для соединения с искусственной вагиной

Искусственная вагина для быка (МтИиЬе). МткиЬе выпускает четыре размера искусственных вагин, подходящих для быков разных пород и размеров. Состоит она из корпуса длиной 20, 30, 35 и 41 см. Внутреннюю латексную камеру надевают на корпус с обоих концов и закрепляют двумя резиновыми кольцами. На середине цилиндра расположен клапан для наливания воды и нагнетания воздуха, чтобы создать определенное давление. На одном конце закрепляют направляющую воронку с градуированной стеклянной емкостью для сбора спермы. На искусственную вагину надевают нагревательный чехол (рис. 9.4).

Искусственная вагина для быка {МтНиЬё)

Рис. 9.4. Искусственная вагина для быка {МтНиЬё)

Искусственная вагина для барана образца 1942г. (рис. 9.5) состоит из твердого эбонитового цилиндра с широким горлышком (патрубком), в которое вставляют резиновую пробку с эбонитовым краном, внутренней резиновой трубки и стеклянного спермоприем-ника.

Искусственная вагина для барана 1942 г

Рис. 9.5. Искусственная вагина для барана 1942 г.

Искусственная вагина для барана {Minitube) состоит из прочного резинового корпуса с клапаном и встроенным искусственным цер-виксом, в который вставляют внутреннюю камеру из латекса. На одном конце закрепляют резиновую воронку с градуированной пробиркой тюльпанообразной формы для сбора спермы объемом 10 мл (рис. 9.6).

Искусственная вагина для барана (М'тИиЬе)

Рис. 9.6. Искусственная вагина для барана (М'тИиЬе)

Резиновая искусственная вагина для хряка состоит из резинового цилиндра, резиновой камеры, патрубка с отверстием, закрываемого эбонитовым краном, резиновой муфты для закрепления спермопри-емника и самого спермоприемника — широкогорлой стеклянной банки или емкости из полиэтиленовой пленки разового применения. На резиновой муфте вырезают небольшое круглое отверстие для выхода воздуха, который вытесняется из спермоприемника по мере его наполнения спермой, а на полиэтиленовом спермоприемнике возле цилиндра вагины для этой цели делают ножницами косой разрез длиной 2—4 мм.

Одноразовая искусственная вагина для хряка {МтИиЬе) является точной копией цервикса свиноматки. Резиновые подушечки искусственной вагины стимулируют хряка и прекрасно удерживают кончик пениса животного. В искусственную вагину интегрированы отрывной внутренний мешочек для пресекрета и трубочка, по которой эякулят стекает в емкость для сбора спермы (рис. 9.7).

Одноразовая искусственная вагина для хряка (М'тИиЬе)

Рис. 9.7. Одноразовая искусственная вагина для хряка (М'тИиЬе)

Водоналивная искусственная вагина для хряка состоит из двухстенного металлического цилиндра с отверстием для наливания горячей воды и собственно вагины, которую после садки заменяют другой (рис. 9.8). Собственно вагина состоит из конусной одностенной трубки с патрубком для нагнетания воздуха. Внутрь этой трубки вставляют резиновую камеру. Спермоприемник закрепляют на искусственной вагине с помощью резиновой соединительной трубки. Давление в вагине создают воздухом, нагнетаемым в пространство между резиновой камерой и конусной трубкой. Температуру воды контролируют термометром, вмонтированным в наружную стенку цилиндра (см. рис. 9.8).

Водоналивная искусственная вагина (конструкция А.В. Квасницкого)

Рис. 9.8. Водоналивная искусственная вагина (конструкция А.В. Квасницкого)

Искусственная вагина образца 1952 г. для жеребца состоит из алюминиевого цилиндра, на который надевают резиновую камеру, фиксируемую резиновыми кольцами. В цилиндр впаян патрубок, в него ввинчивают пробку (гайку) с клапаном для выхода воздуха и скобой для лучшего фиксирования в руке искусственной вагины при получении спермы. Спермоприемник надевают на узкий конец цилиндра.

Искусственная вагина для жеребца модель Colorado (Minitube) состоит из пластикового корпуса, резиновых шлангов трубчатой и конической формы, резиновых колец, зажимов, одноразового вкладыша, стерилизуемой бутылочки для сбора спермы, нейлонового фильтра и термочехла (рис. 9.9).

Искусственная вагина для жеребца модель Colorado (Minitube)

Рис. 9.9. Искусственная вагина для жеребца модель Colorado (Minitube):

1 — одноразовый полиэтиленовый вкладыш; 2, 3 — одноразовые внутренние вкладыши; 4 — бутылочка для сбора спермы вместимостью 300 мл; 5 — фильтр для спермы; 6 — маленький термочехол; 7 — большой термочехол; 8 — резиновая

камера-вкладыш

Для сельскохозяйственных животных приняты следующие размеры цилиндров искусственных вагин (табл. 9.1).

Размеры цилиндров искусственных вагин

Вид животных

Длина, см

Диаметр, см

Бык

30-50

8

Баран

20

5,5

Хряк

26-41

8-9

Жеребец

54

13

Спермоприемники к искусственным вагинам. Для искусственной вагины быка используют стеклянные двухстенные спермоприемники или одноразовые полиэтиленовые (конусообразные) двух видов — простые и конусные с закрытой цилиндрической чехол-пробкой на конце, внутри которой находится отрезок трубчатой муфты с двумя сварными швами. Для искусственной вагины барана используют стеклянные одностенные и двухстенные спермоприемники. Двухстенные на одном конце имеют конусообразное углубление для спермы, а на другом — углубление в виде воронки с отверстием для заполнения межстенного пространства теплой водой. Спермопри-емник имеет объем 50 мл — для вагины барана и 100 мл — для вагины быка. Температура наливаемой воды должна составлять 35—40°С, а спермоприемника к моменту получения спермы, т.е. после обогрева его стенок, — 30—35°С. После наполнения водой и измерения температуры отверстие закрывают резиновой пробкой.

Двухстенные спермоприемники предохраняют сперму от резкого охлаждения, их применяют при температуре воздуха ниже 18°С, а одностенные (с градуировкой) — при температуре выше 18°С.

В искусственной резиновой вагине для хряка спермоприемником служит широкогорлая стеклянная банка вместимостью 500—1000 мл. Если сперму получают при температуре ниже 18°С, на банку надевают поролоновый теплоизоляционный чехол. Для водоналивной искусственной вагины хряка используют прозрачный пластмассовый спермоприемник. Он состоит из колпака и стакана с градуировкой. В колпаке закреплен съемный фильтр для отделения секрета купе-ровых желез от спермы. Оба сосуда соединяются между собой с помощью винтовой нарезки.

Спермоприемник для искусственной вагины жеребца — резиновый или пластмассовый толстостенный сосуд в виде широкого стакана. Стеклянные спермоприемники перед использованием моют в теплой воде, ополаскивают в дистиллированной воде и обеззараживают кипячением или в сушильном шкафу. Одноразовые спермоприемники из полиэтиленовой пленки стерилизуют вместе с укороченной вагиной в автоклаве при 0,5 атм в течение 20 мин. Пластмас-

совый спермоприемник обеззараживают в кипящей воде и ополаскивают 0,9%-м раствором хлорида натрия, резиновый обеззараживают спиртовым тампоном.

Взятие спермы от быка. Сперму от быка получают в манеже в специальном станке через 2 ч после кормления и поения. Позади станка, площадку размером 3 х 3 м покрывают битумом или закрывают толстым многослойным резиновым ковром, чтобы ноги животного во время садки не скользили. В манеже перед работой распыляют воду из распылителя и увлажняют пол, чтобы осадить в воздухе частицы пыли и микробы. Манеж облучают бактерицидными лампами (БУВ-30 или БУВ-60), которые устанавливают около станка.

В день взятия спермы подготовка быков начинается с моциона продолжительностью около 1 ч. Его проводят по сдвоенному кольцевому коридору, один из которых узкий (ширина 800 мм, высота 1700 мм) и предназначен для молодых, а другой более широкий (ширина 1000 мм и высота 1800 мм) — для взрослых быков. Могут использоваться сооружения других типов. Накануне взятия спермы быков моют под душем (температура воды не ниже 18°С) с использованием зеленого мыла. Непосредственно перед взятием спермы быков дополнительно чистят в специально отведенном месте, а брюшную стенку и особенно наружную поверхность препуция обрабатывают 3%-м раствором перекиси водорода или фурацилина (1 : 5000), или фуразолидона (1 : 10 000). Дезрастворы необходимо чередовать. Затем обтирают насухо стерильной салфеткой из прессованной ваты. После такой обработки группу быков водят одного за другим по кругу, чтобы они возбуждались и старались прыгать на впереди идущего производителя. Операторы, находящиеся внутри круга, следят, чтобы в момент прыжка быка его пенис не прикасался к коже животного. Только после наступления сильной эрекции пениса, когда секрет придаточных половых желез промоет мочеполовой канал, быка вводят в манеж для получения спермы. После взятия первого эякулята быка опять водят по кругу в течение 12— 15 мин для активизации половых рефлексов и его подготовки к взятию второго эякулята. Каждый эякулят получают в отдельно приготовленную вагину.

В станке фиксируют любое здоровое животное (вола), соответствующее быку по росту (рис. 9.10). Можно пользоваться также механическим станком (рис. 9.11). Производителя подводят к животному за палку-водило и выдерживают до 5 мин. В момент прыжка производителя вагину держат на уровне таза животного, зафиксированного в станке, в правой руке под углом 40—45°С согласно направлению полового члена. Левой рукой осторожно захватывают препуций, половой член отводят несколько в сторону и направляют в искусственную вагину.

Положение искусственной вагины при получении спермы

Рис. 9.10. Положение искусственной вагины при получении спермы

(по В.С. Шипилову)

Механический станок для взятия спермы у быка

Рис. 9.11. Механический станок для взятия спермы у быка

Во время получения спермы важно своевременно подвести искусственную вагину к пенису быка. Сперму можно брать без фиксации рукой препуция и без отклонения пениса в сторону. Искусственную вагину к пенису подставляют через вырез в верхней части посадочной подушки механического станка. Совокупительный рефлекс и эякуляция у быка длятся не более 6—10 с. В это время выделяются одновременно секреты придаточных желез и спермин.

Сперма выделяется в период характерного толчка. В искусственную вагину за одну садку бык обычно выделяет 4—5 мл спермы.

Получив сперму, вагину поворачивают спермоприемником вниз, открывают кран, выпускают воздух или часть воды, отсоединяют спер-моприемник, закрывают стерильной крышкой и передают в лабораторию. После получения спермы в укороченную вагину с использованием одноразового полиэтиленового спермоприемника вагину вынимают из чучела и прибором «Молния-1» герметизируют полученный эякулят в спермоприемнике путем термической сварки. Затем по метке отрезают спермоприемник с эякулятом. На спермоприемнике записывают номер или кличку быка, номер эякулята и через стерильный шлюз передают в лабораторию. Спермоприемники помещают в отдельные секции камеры термостата, где автоматически поддерживается оптимальная постоянная температура 27 ± ГС. В лаборатории край спермоприемника протирают спиртовым тампоном, срезают угол и переливают в теплую мензурку сперму для определения ее объема и качества. Поступивший в лабораторию эякулят в полиэтиленовом спермоприемнике с чехлом-пробиркой можно взвесить на весах ВТК-20, ВТК-500 или Р-2-200, считая, что 1 мл спермы весит 1 г. Путем сжимания концевой части чехол-про-бирки ее заполняют спермой. Затем на уровне второго шва чехол-пробирку ножницами отделяют от спермоприемника, в ее отверстие вставляют конец микропипетки, в которую набирают 0,1 мл спермы для определения концентрации спермиев. К оставшейся в пробирке части спермы вносят 2—3 капли теплого раствора лимоннокислого натрия и проводят оценку активности спермиев под микроскопом. Спермоприемник со спермой фиксируют в специальном штативе.

Вагину передают в моечную, выливают из нее воду, опускают в ванну с горячим раствором фурацилина (1 : 5000) или в кипящую воду, отмывают от вазелина в содовом растворе, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают и обеззараживают.

Взятие спермы у барана. Станки для фиксации манекена при взятии спермы у баранов деревянные или металлические. Подобные станки могут быть использованы и для фиксации овец при осеменении (рис. 9.12). Сначала, когда бараны еще не приучены к искусственной вагине, сперму у них берут только на овец в охоте, затем постепенно приучают делать садки на овец вне охоты, валухов и других баранов. Садка у барана происходит очень быстро. Техник садится на корточки с правой стороны от животного в станке и держит искусственную вагину на уровне таза овцы под углом 35° спермоприемником вверх, придерживая его указательным пальцем. На эякуляцию указывает характерный толчок вперед, затем баран соскакивает с животного.

После взятия спермы искусственную вагину повертывают спермоприемником вниз, чтобы в него стекла сперма, открывают краник и проводят остальные приемы, как при взятии спермы у быка.

6

Станки для взятия спермы у баранов

Рис. 9.12. Станки для взятия спермы у баранов: а — деревянный; б — металлический

Взятие спермы у хряка. Сперму от хряков получают на универсальное или деревянное чучело свиньи. Универсальное чучело позволяет получать сперму как в резиновую, так и металлическую вагину Сверху чучело покрыто мягкой поролоновой прокладкой с обогревом его задней поверхности, вагины и спермоприемника. Обогрев воды в чучеле производится электрической обогревательной спиралью с терморегулятором. В чучеле укреплен домкрат, при помощи которого можно регулировать высоту задней части чучела по отношению к высоте хряка. Домкрат управляется дистанционно (рис. 9.13).

Чучело для взятия спермы у хряков

Рис. 9.13. Чучело для взятия спермы у хряков

Применяют также чучело свиньи, изготовленное из мягкого дерева (рис. 9.14 и 9.15), укрепляют его на деревянной площадке, сзади него площадку покрывают резиновыми ковриками с ребристой поверхностью, чтобы ноги хряка не скользили во время садки. В чучеле устраивают гнездо, в которое помещают искусственную вагину и спермоприемник и укрепляют их специальным приспособлением. Гнездо обогревается с помощью электролампочек. По бокам чучела делают упоры для передних ног хряка. Откидная (на петлях) спинка чучела позволяет легко и быстро вставлять в него (и вынимать) искусственную вагину со спермоприемником. Чтобы хряк не мог открыть спинку, она закрепляется защелкой. Снизу у передних ножек чучела прикреплена штепсельная розетка для включения электролампочек в сеть.

Для приучения хряка к садке на чучело сначала допускают несколько садок на свиноматку в охоте, а затем вместо нее ставят чучело, покрытое шкурой от здоровой убитой свиноматки. Половые рефлексы закрепляются после 1—3 садок на чучело, сопровождающихся эякуляцией. После того как хряк привыкнет к чучелу, шкуру снимают. Некоторые самцы быстро проявляют половые рефлексы на чучело, если в их присутствии проводят садки на чучело другого, уже приученного хряка. Производители также хорошо проявляют

половые рефлексы на чучело, если его оросить небольшим количеством спермы хряков или смывом из влагалища свиньи в охоте. Каждый раз после окончания работы чучело моют теплой водой с мылом, насухо вытирают полотенцем и обеззараживают 2%-м раствором хлорамина или 3%-м раствором перекиси водорода.

2

Деревянное чучело свиньи

Рис. 9.14. Деревянное чучело свиньи:

1 — искусственная вагина; 2 — откидная спинка; 3 — спермоприемник; 4 — электророзетка для включения подогрева вагины; 5 — упоры для передних ног хряка;

б — электрошнур

Схема деревянного чучела свиньи для взятия спермы у хряка

Рис. 9.15. Схема деревянного чучела свиньи для взятия спермы у хряка:

7 — вагинодержатель; 2 — вагина; 3 — спермоприемник; 4 — деревянные планки; 5 — упоры для ног хряка; 6 — площадка с ребристой поверхностью; 7 — гнездо для вагинодержателя и вагины; 8 — опорные планки для вагинодержателя

Перед получением спермы хряка моют в душевой и обсушивают в сушилке. Препуций снаружи обмывают теплой водой и насухо вытирают. Подготовленную вагину вставляют в чучело. Затем прогоняют хряка в манеже и получают от него сперму.

Для взятия спермы у хряка применяют те же искусственные вагины, что и для взятия спермы у быка, — с соединительной муфтой для спермоприемника. Вагина должна быть индивидуальной для каждого хряка и соответствовать размеру выводимого из препуция пениса во время проявления полового рефлекса. Подготовка искусственной вагины для взятия спермы у хряка такая же, как при взятии спермы у производителей других животных.

В зависимости от размеров полового члена требуются следующие размеры вагин (табл. 9.2).

Таблица 9.2

Размеры искусственных вагин

Размер выводимой из препуция части полового члена, см

Длина цилиндра искусственной вагины, см

25-30

25

30-35

30

35-40

35

40-45

40

Чтобы определить нужную длину искусственной вагины, подготавливают для получения спермы вагину длиной 26 см со спермо-приемником и резиновой соединительной муфтой длиной 20 см. Во время проявления хряком совокупительного рефлекса рукой сдавливают снаружи соединительную муфту и определяют длину вводимой в нее части полового члена. Чтобы иметь доступ к соединительной муфте, в станке делают окошко. Выделение спермы продолжается в среднем 7—8 мин. Во время садки хряка сначала можно наблюдать проявление совокупительного рефлекса, затем хряк успокаивается и начинает выделяться сперма. Во время выделения основной массы спермы хвост у хряка закручивается кверху, остается почти неподвижным, семенники подтягиваются, мошонка становится слабонапряженной и частично отвисает, заднепроходное отверстие пульсирует. За одну садку хряк выделяет около 250 мл спермы.

По окончании эякуляции хряка выводят из манежа, а искусственную вагину вынимают из чучела, выпускают из нее воздух, отсоединяют спермоприемник, удаляют фильтр с секретом куперовых желез, закрывают крышкой и передают в лабораторию для оценки качества спермы. При использовании одноразового полиэтиленового спермоприемника после получения спермы вагину вынимают из чучела и прибором «Молния-1» герметизируют полученный эякулят в спермоприемнике, отделяют ножницами часть спермопри-емника с эякулятом и передают его в лабораторию. В лаборатории край спермоприемника протирают спиртовым раствором, срезают угол и фильтруют сперму через стерильную марлю в теплую мензурку. После отделения спермоприемника искусственную вагину передают в моечную.

Взятие спермы у жеребца. Садку жеребца допускают на кобылу в охоте. Чтобы кобыла стояла спокойно, на нее надевают случную шлейку. Хвост бинтуют полотняным бинтом, отводят в сторону и фиксируют, чтобы он не мешал во время получения спермы.

Жеребца к самке подводят, придерживая за повод. Во время садки подготовленную вагину прижимают к крупу кобылы с правой стороны и придают ей положение, соответствующее направлению пениса. Половой член жеребца осторожно левой рукой направляют в искусственную вагину. Во время совокупительного рефлекса необходимо выпустить из искусственной вагины часть лишнего воздуха, повернув на пол-оборота гайку, завинчивающую патрубок. После выхода лишнего воздуха гайку плотно завинчивают. По окончании эякуляции искусственную вагину, не снимая с пениса, наклоняют спермоприемником вниз, чтобы в него стекла сперма. В наклонном положении искусственную вагину фиксируют до окончания выделения спермы. О ее выделении можно судить по следующим признакам: с момента выделения спермы прекращаются совокупительные движения, ритмически сокращается мускулатура корня хвоста. Продвижение спермы по мочеполовому каналу можно ощущать по его пульсации, если приложить пальцы к нижней поверхности полового члена у препуция. У жеребца эякуляция длится 10—20 с, за одну садку он выделяет 50— 120 мл спермы.

Получив сперму, спермоприемник отделяют от искусственной вагины. Сперму выливают в теплую стерильную мензурку через стерильную марлевую салфетку и освобождают от густого тягучего секрета пузырьковидных желез. Мензурку со спермой закрывают крышкой и передают в лабораторию для дальнейшей технологической обработки. Искусственную вагину обеззараживают, отмывают от вазелина, высушивают и повторно обеззараживают.

Взятие спермы у птиц. Вагина для петуха состоит из основного цилиндра, сделанного из твердого каучука воронкообразной формы (рис. 9.16). Длина вагины — 5 см, диаметр у входа — 5 см, у выхода — 1,5 см. Внутренняя трубка вагины сделана из каучука. В такую вагину получают сперму и от индюков. Искусственная вагина для селезня состоит только из основного цилиндра. Ее длина — 10 см. Входная часть имеет воронкообразную форму, что облегчает введение полового члена. Ее диаметр — 5 см, а на остальном протяжении вагины — 1,5 см.

а) б)

Рис. 9.16. Искусственные вагины (по К. Баранову): а — для петуха; б — для селезня

Получить сперму от птицы несложно. Сначала производителя приучают делать садку на самку, фиксированную руками. Для удобства работы применяют высокий стол. При получении спермы птицу фиксируют левой рукой, а в правой руке держат вагину. В момент проявления обнимательного рефлекса искусственную вагину подносят к клоаке птицы. Половой член у петуха отсутствует. Поэтому совокупительного рефлекса нет, и эякуляция заканчивается быстро, характерным толчком. У селезня совокупительный рефлекс и эякуляция продолжаются от 2 до 5 мин. Половой член хорошо развит, его длина Ю—12 см и более. Для облегчения введения полового члена селезня в вагину утку фиксируют на краю стола в распластанном состоянии.

Предварительно петухов тренируют для выработки у них условного рефлекса выделения спермы на массаж. Желательно это делать через день в одни и те же часы (лучше в 9—10 ч). Обычно бывает достаточно 3—5 тренировок. Для массажа один из техников берет левой рукой петуха за обе голени и держит его так, чтобы он находился под левой рукой головой назад. Правой рукой техник делает легкий, но интенсивный двусторонний массаж по направлению от киля вдоль лонных костей к хвостовой части. Другой человек большим и указательным пальцами слегка нажимает с обеих сторон на клоаку, что приводит к эрекции копулятивного органа и эякуляции.

Сперму у петухов может получить и один человек. Для этого подстригают возле клоаки все перья, а также перья, спускающиеся возле хвоста вниз. Человек, надев фартук, садится на стул и держит петуха головой налево, зажав обе его ноги коленями. В правой руке между указательным, средним и безымянным пальцами техник держит спермоприемник, а большим пальцем и мизинцем движением от киля к хвосту массирует нижнюю часть живота птицы. Одновременно левой рукой он поглаживает поясничную область спины по направлению от груди к хвосту петуха. Через несколько секунд петух начинает реагировать на массаж, поднимая хвост. В это время техник большим и указательным пальцами левой руки делает легкий массаж задней части живота петуха и при эрекции копулятивного органа сжимает клоаку пальцами левой руки, собирая сперму в спермопри-емник. Удобно получать сперму в градуированный двухстенный спермоприемник. Сперму у петухов берут через день по 1—2 эякулята. Для получения второй порции спермы процедуру массажа района клоаки следует повторить. Сперму нужно постоянно проверять на концентрацию, подвижность и жизнеспособность спермиев. Помимо выбраковки неэффективных петухов, такой анализ позволяет рассчитывать разбавление спермы для увеличения числа оплодотворяемых ею кур: от 1 : 10 — при естественном спаривании до 1 : 20 — при искусственном осеменении.

Второй эякулят надо получать, лишь если первого недостаточно для осеменения кур, закрепленных за этим петухом. Необходимо иметь в виду, что сперма второго эякулята в большинстве случаев бывает более редкой. Получаемая от петухов сперма должна быть чистой, без примеси помета, крови, мусора и пыли, с активностью не менее 7 баллов.

Сперма сельскохозяйственных птиц менее чувствительна к холоду, чем сперма млекопитающих. Однако резкое охлаждение тоже ухудшает ее оплодотворяющую способность. Температура в помещении должна быть не ниже 15— 18°С, а температура спермоприем-ника — в пределах 35—42°С.

Сперму от петухов можно получать, используя электроэякулятор. Электроэякулятор подключают к электросети, напряжение на выходе из прибора — около 49 В, а силу тока (в миллиамперах) устанавливают в зависимости от ситуации. Предварительно петуха фиксируют в специальном станке, установленном на небольшом столе; один проводник от прибора, оканчивающийся иглой, вводят в эпидермис кожи в области подвздошной кости. Другой проводник, оканчивающийся хорошо отполированным наконечником, вводят в клоаку и массируют ее круговыми движениями наконечника. Затем ключом, находящимся на панели электроэякулятора, замыкают цепь на 2—3 с. Выделившуюся сперму наносят на предметное стекло и оценивают под микроскопом.

Этот метод дает хорошие результаты. Обычно удается отобрать около 25% петухов с высокими показателями качества спермы. При спаривании кур с такими петухами оплодотворенность яиц кур кросса 288 равнялась 98—99,5%.

Для получения спермы используют градуированный двухстенный спермоприемник. Между его стенками наливают воду, нагретую до 25—30°С. Теплая вода препятствует резкому снижению температуры спермоприемника и спермы, а имеющиеся деления на стенках внутренней емкости позволяют сразу определить объем полученного эякулята. Спермоприемник после получения спермы закрывают пробкой или ватой.

Взятие спермы у кобелей. От кобелей сперму получают способом мастурбации на искусственную вагину и с помощью электроэякуляции.

При получении спермы способом мастурбации после легкого массажа через препуций пенис выводится дальше пещеристого тела, обхватывается пальцами под пещеристым телом кольцеобразно и ритмично сдавливается. После эрекции кобель может выполнять тазом энергичные поисковые и фрикционные движения. После наступления полной эрекции кобель начинает переворачиваться, что соответствует фазе склещивания, которая должна длиться 10—15 мин. Склещивание имитируют также тем, что одну из тазовых конечностей поднимают на руку, проводящую мастурбацию.

Ассистент обычно находится справа от собаки (если он правша). Суку в охоте фиксируют за шею и голову. При попытке кобеля сделать садку ассистент правой рукой фиксирует половой член через препуций (крайнюю плоть). Рукой двигают крайнюю плоть вперед-назад, затем при возникновении эрекции препуций оттягивают к основанию полового члена, чтобы из препуция показались луковицы полового члена. Затем тело полового члена пережимают у основания луковиц полового члена, после чего начинается эякуляция и сперму собирают в подготовленные емкости (спермоприемники).

Сперму от кобеля получают и по общепринятой методике — на искусственную вагину. Заготавливать сперму от кобелей можно 2—3 раза в течение недели. Предварительно внутреннюю полость резиновой камеры дезинфицируют тампонами, смоченными в 70° спирте, а спермоприёмник — кипячением. После дезинфекции резиновую камеру слегка смазывают стерильным разбавителем. Через кран между камерой и корпусом заливают горячую воду, а к узкому концу вагины присоединяют спермоприемник. Температура в вагине должна быть 4ГС, чтобы получить такую температуру, в камеру заливают 250—450 мл воды. Через носик крана подкачивают воздух до смыкания стенок резиновой камеры. Во время получения спермы часть воздуха может быть выпущена.

Сперму от приученного кобеля получают на искусственную вагину в присутствии самки в состоянии охоты. Заранее внутреннюю полость препупиального мешка и волосяной покров снаружи промывают раствором фурацилина (1 : 5000) и снаружи просушивают стерильными марлевыми салфетками. Под живот подвязывают стерильный фартук с отверстием для пениса. После нескольких фрикций кобеля в вагину, наступление эрекции и эякуляция всех трех фракций спермы происходит в первую минуту. Искусственную вагину снимают с пениса кобеля до окончания эрекции, поворачивают вертикально спермоприемником вниз, чтобы вся сперма поступила в спермоприемник.

Далее от вагины отсоединяют спермоприемник и полученный эякулят оценивают макроскопически (объем, цвет, запах, консистенция) и микроскопически (густота, подвижность, концентрация, наличие патологических спермиев).

Искусственную вагину подвергают разборке (неполной) и дезинфекции. Отсоединяют кран и из камеры выливают воду. Полость рабочей резиновой камеры тщательно промывают 3%-м раствором соды, просушивают и промывают дистиллированной водой. Корпус вагины протирают тампонами, смоченными 0,02%-м раствором фу-рацилина. Вагину просушивают и хранят в шкафу.

Метод электроэякуляции обеспечивает возможность получения спермы от самцов, от которых по рефлексологическим или иным причинам невозможно получить сперму другими способами.

Используют прибор для электроэякуляции, который имеет биполярный электрод для введения в прямую кишку или два электрода: один накладывают на шейку мошонки, другой вводят в прямую кишку. Предварительно животному вводят небольшое количество седативных препаратов. Электрические импульсы, вырабатываемые электродом, воздействуют на срамной и наружный семенной нервы и гладкую мускулатуру половых органов. Гладкие мышцы сокращаются, вызывая эякуляцию. Оптимальные выходные данные прибора: напряжение — 16 В, частота — 50 Гц. Подают 7—8 импульсов продолжительностью 5 с с 10-секундными паузами.

Сперму собирают в пластиковый стакан, сделанный из нетоксичной пластмассы. Сперма при эякуляции поступает фракциями. Первая фракция — секрет уретры прозрачного цвета. Вторая фракция — собственно сперма белого цвета. По возможности ее собирают в отдельный стакан. Третья фракция — секрет простаты. Ее также собирают в отдельную емкость.

Оценка спермы. На племенных предприятиях и пунктах осеменения решающим показателем воспроизводительной способности племенных производителей является качество получаемой спермы и ее оплодотворяющая способность. У разных производителей качество спермы неодинаково и может изменяться под влиянием условий их кормления, содержания, использования, также оно зависит от индивидуальных особенностей производителей, состояния их здоровья, возраста, сезона года, температуры внешней среды и других факторов.

Общая макроскопическая оценка качества спермы. Цвет нормальной спермы белый или с желтым оттенком. Сероватый или голубоватый оттенок — признак олигоспермии (недостаточное число спермиев). Очень желтый цвет обычно указывает на примесь мочи. Розоватый или красноватый цвет — признак примеси крови как следствие свежей травмы. Буро-красный цвет указывает на глубокую травму половых путей давнего происхождения. Зеленоватый оттенок сперма приобретает от примеси гноя. Хлопья в сперме наблюдаются при воспалении пузырьковидных желез.

Запаха нормальная сперма не имеет или она обладает легким запахом жиропота.При хронических гнойных процессах в семенниках или придаточных половых железах сперма может иметь гнилостный запах и зеленоватый оттенок.

Консистенция спермы быка сливкообразная, барана — сметанообразная, жеребца и хряка — наподобие молока.

Макроскопическое исследование не дает оснований для заключения о пригодности или непригодности спермы. Но его результаты служат предпосылкой для тщательного микроскопического исследования спермы, которое позволяет установить качество спермы и спермиев, а также причины изменения внешнего вида спермы.

Микроскопическая оценка качества спермы. При микроскопическом исследовании спермы выявляются следующие ее элементы и примеси:

  • 1) спермии нормальные и патологические;
  • 2) клетки плоского и переходного эпителия, клетки семенных канальцев (зернистые);
  • 3) форменные элементы крови — эритроциты и лейкоциты;
  • 4) гиалиновые шары (круглые и овальные, иногда слоистые и напоминающие зерна крахмала), амилоидные тельца, сильно блестящие — лецитиновые зернышки, кристаллы спермина и др.

Оценка качества спермы по густоте и подвижности спермиев. При этом определяют степень насыщенности спермы спермиями и процент спермиев, имеющих прямолинейно-поступательное движение. Для проведения оценки качества спермы по густоте и подвижности спермиев необходимы следующие материалы и оборудование: спер-моприемники, флаконы, ампулы, мензурки со спермой быка, барана, хряка и жеребца; микроскоп, столик Морозова или термостат; предметные и покровные стекла, стеклянные палочки или глазные пипетки; вата, марлевые салфетки; сливная чашка.

Густоту и подвижность спермиев определяют с помощью микроскопа, дающего увеличение в 120—280 раз. Для оценки спермы на стол перед окном или искусственным источником света ставят микроскоп. Из чашки Петри берут чистое предметное стекло. Стерильной пипеткой или стеклянной палочкой наносят каплю спермы на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и ставят препарат на предметный столик микроскопа, помещенный в специальный термостат (температура 38—40°С), или исследуют его с использованием столика Морозова.

Обогревательный столик Морозова — это металлический сосуд в виде диска со сквозным отверстием в центре для прохождения света при микроскопировании. На верхней площадке сосуда расположено отверстие для наполнения его теплой водой, закрываемое пробкой. На боковой стороне сосуда устроено гнездо для термометра. Перед использованием в сосуд наливают воду температурой 60—65°С, ставят его на предметный столик микроскопа, в гнездо вставляют термометр и, когда температура внутри столика будет 42—45°С, на его верхнюю площадку помещают препарат с исследуемой спермой. Предметное стекло и исследуемая сперма при этом нагреваются до температуры 38—40°С. По мере остывания воды в столике ее заменяют теплой (рис. 9.17).

а)

б) в)

Рис. 9.17. Приборы для обогревания спермы (по А.М. Петрову): о и б — электрические термостаты; в — столик Морозова

В зависимости от насыщенности спермиями не разбавленная сперма может иметь следующие оценки: густая (Г), средняя (С) и редкая (Р). Сперма различных производителей значительно отличается по густоте. Бараны, например, выделяют наиболее густую сперму по сравнению с другими производителями. Густота спермы хряка и жеребца примерно в 10 раз меньше, чем барана.

Сперму считают густой, когда под микроскопом все поле зрения заполнено спермиями так, что между ними почти не видно промежутков. В густой сперме обычно трудно различить движение отдельных спермиев. Средняя сперма, когда в поле зрения микроскопа заметны промежутки между спермиями; хорошо различимо движение отдельных спермиев. Редкой считается сперма, в которой спермии размещены в поле зрения микроскопа так, что между отдельными спермиями имеются большие промежутки. Когда в исследуемой сперме не находят спермиев, такую сперму оценивают буквой «А» (сокращенное обозначение аспермия). Различают также олигоспермию, когда в сперме обнаруживаются лишь единичные спермии.

Бараны, как правило, выделяют только густую сперму (более 2 млрд/мл), быки — густую и среднюю (0,5—1 млрд/мл), у хряков и жеребцов в густой сперме содержится более 0,2, в средней — 0,11— 0,2 и в редкой — менее 0,1 млрд/мл. Разрешается использовать сперму (до разбавления): барана — густую; быка — густую и средней густоты; хряка и жеребца — густую и средней густоты (рис. 9.18).

а) б) в)

Рис. 9.18. Оценка спермы по густоте: а — густая; б — средней густоты; в — редкая

Наряду с оценкой спермы по густоте под микроскопом определяют процент спермиев с прямолинейно-поступательным движением. По подвижности спермиев (поступательному движению) сперму оценивают глазомерно по десятибальной шкале. Балл соответствует проценту содержания спермиев с прямолинейно-поступательным движением. Например, когда все спермии обладают прямо-линейно-поступательным движением, сперму оценивают в 10, когда таких спермий 90% — в 9, когда 80% — 8 баллов и т.д.

Сперму с манежным движением оценивают буквой «М», а с колебательным движением — буквой «К». Неподвижных спермиев обозначают буквой «Н» (неподвижность). Если менее 10% спермиев имеют прямолинейно-поступательное движение, то такую сперму обозначают буквой «Е» (единичные). Окончательную оценку спермы производят по двум показателям: по густоте и подвижности. Например: Г-10 — сперма густая и около 100% спермиев имеют прямолинейно-поступательное движение; С-9 — сперма средней густоты и около 90% спермиев имеют прямолинейно-поступательное движение; Р-7 — сперма редкая и около 70% спермиев обладают прямо-линейно-поступательным движением.

Для разбавления и хранения используют сперму барана с оценкой не ниже Г-9, быка и хряка — Г-8 и С-8, жеребца — не ниже Г-5 и С-5.

Определение процента живых и мертвых спермиев методом дифференциальной окраски. При смешивании спермы с водным раствором эозина живые спермии с прямолинейно-поступательным движением не окрашиваются, а мертвые и ослабленные (с колебательным движением) имеют повышенную проницаемость для красителя и вследствие этого окрашиваются. Для определения процента живых и мертвых спермиев методом дифференциальной окраски необходимы следующие материалы и оборудование: свежеполу-ченная сперма, обезжиренные предметные и покровные шлифованные стекла, стеклянная палочка или глазная пипетка, вата, 5%-й водный раствор эозина, микроскоп.

Для определения процента живых и мертвых спермиев на край обезжиренного предметного стекла пипеткой или стеклянной палочкой наносят небольшую каплю спермы и 2—3 капли 5%-го водного раствора эозина. Капли быстро перемешивают стеклянной палочкой и из смеси делают тонкий мазок на предметном стекле. Мазок быстро высыхает на воздухе. Подготовленный мазок просматривают под микроскопом при увеличении 400—600 раз. В нескольких полях зрения микроскопа подсчитывают подряд 500 спермиев неокрашенных (живых) и окрашенных в розовый цвет (мертвых). Для определения процента живых спермиев пользуются следующей формулой:

Ж-100 500 ’

где П — процент живых спермиев; Ж — число сосчитанных неокрашенных (живых) спермиев.

Полученный процент живых спермиев выражают согласно активности спермиев в баллах. Процент живых и мертвых спермиев в сохраняемой сперме жеребца определяют по такой же методике, но вместо эозиновой краски для окрашивания мертвых спермиев применяют краску конго-рот, причем на 100 мл 7%-го раствора глюкозы берут 1 г краски.

Определение процентного соотношения нормальных и патологических форм спермиев. Среди нормальных спермиев всегда находится какое-то количество их патологических форм. Чаще аномалии выявляются в хвостовой части спермиев, основании головки и шейки. С возрастом к моменту физиологической зрелости производителя количество аномальных спермиев уменьшается. Могут встречаться самые различные патологические формы спермиев: гигантского размера или карликовые, с двумя-тремя головками, но общим хвостиком, с двумя хвостиками, с укороченным хвостиком, его деформацией или отсутствием, с протоплазматической капелькой, слишком большой или маленькой головкой и др. Иногда встречаются спермии, лишенные головки, но способные двигаться (рис. 9.19).

Установлено, что признаки патологических спермиев — слабо выраженный перфораторий или его отсутствие. Нарушение структуры перфоратория и оболочки спермия является признаком начальных изменений спермиев при их хранении.

Большое количество патологических спермиев свидетельствует о нарушении спермиогенеза, неблагоприятном воздействии инфицированных различной микрофлорой секретов придаточных половых желез и мочеполового канала, указывает на нарушение правил получения спермы и ее хранения.

В качестве конкретных причин образования уродливых форм спермиев отмечают: 1) слабо развитые семенники; 2) поражения семенника и придатка (гигантские и карликовые спермии); 3) длительные промежутки между коитусами, обусловливающие старение и распад спермиев в придатке (отдельные головки, изолированные хвостики); 4) половое истощение производителя вследствие большой половой нагрузки или недостаточного кормления (спермии с прото-плазматическими капельками в области шейки, тела и хвоста — незрелые спермии). Чем ближе к головке расположена капелька, тем моложе спермий.

Большое значение в образовании патологических форм спермиев придается нарушению терморегулирующей функции мошонки. Если в сперме жеребца содержится до 150—300 патологических спермиев на 1000, то она считается нормальной. Быки, дающие сперму с содержанием более 18%, а бараны — более 14% уродливых спермиев, должны рассматриваться как бесплодные. Значительное количество патологических спермиев следует, безусловно, расценивать как признак наступающей импотенции.

Патологические формы спермиев быка (по Бретшнейдеру)

Рис. 9.19. Патологические формы спермиев быка (по Бретшнейдеру):

а — форма и величина головки: 7—3 — нормальная; 4 — узкая; 5 — грушевидная; 6 — ланцетовидная; 7 — лопатовидная; 8 — колбовидная; 6 — основание головки и шейка: 7 — нормальная; 2 — прямая; 3 — суженная; 4 — узкая; 5 — широкая; 6 — симметричная; 7 — несимметричная; 8 — с изломом; 9 — с перегибом; 70 — с разломом; 7 7 — отсутствие головки; в — тело: 7 — нормальное; 2 — короткое; 3 — широкое; 4 — тонкое; 5 — уродливое; 6 — разрывы; 7 — перегибы; 8 — осевой тип; 9 — расщепленное; г — хвостик: 7 — капелька на шейке; 2 — на теле; 3 — на хвостике; 4 — при изгибах хвостика; 5 — петлеобразное; б — в форме завитка; 7 — хвостик вокруг головки; 8 — рудиментарный; 5 — уродливые спермин: 7 — одноголовый двухвостый; 2 — одноголовый треххвостый; 3 — одноголовый четыреххвостый; 4 — двухголовый двуххвостый; 5 — двухголовый четыреххвостый

Для определения процентного соотношения нормальных и патологических форм спермиев необходимы следующие материалы и оборудование: сперма, предметные стекла, спиртовая горелка, раствор фуксин-эозина или метиленовой синьки, фильтровальная бумага, пипетки, дистиллированная вода, микроскоп. На мазок кладут полоску фильтровальной бумаги, чтобы нерастворившиеся кусочки краски не осели на стекле и не мешали подсчету. Раствор краски наливают на бумагу. Краску со стекла смывают водой и высушивают мазок на воздухе. Просохший мазок просматривают под микроскопом при увеличении 400—600 раз и подсчитывают в нескольких полях.

В каждом поле зрения подсчитывают нормальные и патологические спермии, а затем вычисляют процент их содержания. К патологическим формам спермиев относят: гигантских и карликовых, с деформацией головки, двумя головками, надломом шейки, изолированными головками, искривленным или закрученным хвостом, двумя хвостами, утолщением хвоста и пр.

Высокий процент патологических форм спермиев снижает оплодотворяющую способность спермы и может быть одной из причин бесплодия производителей.

Важно, что оплодотворяющая способность может быть определена только в отношении определенной группы самок, находящихся в конкретных условиях существования и времени осеменения. Оплодотворение зависит от степени родства самки и производителя, от состояния их здоровья, упитанности, качества кормления и др. Поэтому для определения оплодотворяющей способности спермы лучше всего использовать здоровых ремонтных телок. Сперма считается нормальной, если оплодотворяемость при первом осеменении составляет не менее 70%. Быки с пониженной оплодотворяющей способностью спермы дают нежизнеспособное потомство и их нельзя использовать при искусственном и естественном осеменении (табл. 9.3).

Таблица 9.3

Минимальные показатели свежеполученной спермы, пригодной для разбавления и осеменения коров, овец, свиней и кобыл

(по А.М. Петрову)

Вид

живот

ного

Актив

ность,

баллов

Концентрация спермиев в 1 мл, млрд

Вид

живот

ного

Актив

ность,

баллов

Концентрация спермиев в 1 мл, млрд

Быки

8

0,5

Хряки

7

0,15

Бараны

8

2,0

Жеребцы

5

0,15

Правильно сделанная биологическая проба спермы для естественного осеменения здоровых животных — самый надежный критерий ее оценки. Все другие методы определения оплодотворяющей способности спермы являются косвенными.

Наблюдения показали, что даже всестороннее лабораторное исследование спермы иногда не отражает ее качеств. При использовании спермы, полученной от некоторых жеребцов и имеющей прекрасные лабораторные показатели, оплодотворяемость кобыл оказывалась низкой, если интервалы между садками были больше 48 ч. Осеменение кобыл через 24—36 ч этими же производителями давало резкое повышение плодовитости. Этот факт Х.И. Животков объясняет неодинаковой выживаемостью спермиев отдельных производителей в половом аппарате матки. Он предлагает применять у ценных производителей биологическую пробу, заключающуюся в осеменении кобыл через различные промежутки времени. На основании учета итогов этих осеменений устанавливают индивидуальную половую нагрузку.

Определение качества спермы птиц. При общей оценке спермы сначала проводят внешний осмотр полученного эякулята. Нормальная сперма молочно-белого или слегка желтоватого цвета, сливкообразной консистенции. При наличии в сперме крови она имеет розовато-красный цвет, при загрязнении пометом — желтовато-коричневый. Моча видна в сперме в виде белых хлопьев. Эякулят, отклоняющийся от нормы по внешним признакам, нельзя использовать для искусственного осеменения птиц.

На качество спермиев влияют физко-химические свойства окружающей среды. Из многочисленных факторов, влияющих на жизнеспособность спермиев, наибольшую роль играют температура, pH, буферность, осмотическое давление, ионный состав окружающей среды и свет. Значение этих условий бывает различным в зависимости от того, для какой цели предполагается использовать сперму.

Для движения спермиев оптимальной является температура, равная температуре тела животных, хранить же сперму желательно при возможно более низкой температуре, когда обменные процессы в спермиях резко заторможены, энергетические запасы расходуются экономно, меньше образуется продуктов распада, отрицательно влияющих на их жизнеспособность. Уменьшение температуры спермы на 10°С замедляет дыхание спермиев вдвое, а при 0°С их дыхание протекает еще медленнее. Однако резкое снижение температуры спермы до 0°С вызывает температурный шок. Это явление особенно выражено у спермиев млекопитающих, но оно присуще и спермиям птиц. Поэтому рекомендуется получать сперму в теплый спермоприемник (около 25°С) и снижать ее температуру со скоростью 1,5—2°С/мин.

Для лучшей активизации движения спермиев птиц оптимальна pH, близкая к нейтральной (7) или слабощелочной (7,2). В сильно кислой среде у спермиев наступает кислотный анабиоз. Впервые это явление было установлено в 1924 г. К.Н. Крыжишкиовским и Г.Н. Павловым. Они поместили сперму млекопитающих в запаянный капилляр и, вскрыв его после суточного хранения при температуре 10°С, обнаружили спермии без признаков движения, которое восстановилось после соприкосновения спермы с воздухом. Инактивацию движения спермиев они объяснили торможением, вызванным накопившимися кислотами, а восстановление движения — обогащением среды кислородом.

Резкому изменению pH препятствуют буферные свойства спермы, создаваемые солями, слабо диссоциированными кислотами, белками и другими соединениями, имеющимися в ее плазме. Для придания буферных свойств сперме в нее вводят цитрат натрия или соли фосфорной и угольной кислот.

Сохранение биологических свойств спермиев в значительной степени зависит от величины осмотического давления окружающего раствора. Оптимально осмотическое давление плазмы спермы или разбавителя равно осмотическому давлению содержимого спермиев. Величину осмотического давления измеряют в атмосферах или в депрессии (температура, при которой происходит замерзание спермы). Точка замерзания спермы петухов — 0,63—0,67°С.

Широкие колебания осмотического давления в плазме спермы и применяемых средах вредно сказываются на биологических свойствах спермиев. При его снижении, или, иначе говоря, в гипотонических средах, происходит избыточное проникновение воды в спермии, в результате чего они набухают. Следовательно, снижается их оплодотворяющая способность. Поэтому всякий раз, когда ведется разработка сред, необходимо добиваться их изотоничности, чтобы осмотическое давление в них было такое же, как и в содержимом спермиев.

Отрицательно воздействует на спермии прямое солнечное освещение, так как ультрафиолетовые лучи их убивают. Такое же вредное воздействие оказывают некоторые лекарственные вещества, применяемые для дезинфекции, поэтому пункты искусственного осеменения должны быть изолированы от производственных и вспомогательных помещений.

Для правильной оценки самцов по спермопродукции за две недели до анализа их сажают в клетки небольшими группами, так как в больших группах выделяются самцы-лидеры, которые подавляют остальных, ухудшая их физиологическое состояние вообще и показатели спермы в частности.

В течение двухнедельной выдержки в отведенных клетках самцы привыкают к обстановке и обслуживающему персоналу. Это необходимо для успешной выработки у них положительного рефлекса на массаж, сопровождающегося эрекцией копулятивного органа и выделением спермы.

Оценку качества спермы начинают после введения самцов в установленный режим, когда образовался устойчивый рефлекс выделения спермы на массаж.

Для прогнозирования качества спермы достаточно оценить ее в начале племенного сезона в 3—5 эякулятах. Это позволит получить полное представление о спермопродукции самцов в последующий период племенного сезона.

Объем эякулята измеряют по делениям на спермоприемнике или градуированной пипеткой на 1—2 мл. Установлены следующие средние объемы эякулятов при однократном получении спермы у петухов — 0,2—0,5 мл.

По густоте и активности сперму оценивают по общепринятой методике под микроскопом при увеличении в 300—400 раз (рис. 9.20). Неразбавленная сперма по густоте в зависимости от концентрации спермиев в 1 мл может иметь следующие оценки:

  • густая сперма (Г) — все поле зрения микроскопа густо заполнено спермиями;
  • средняя сперма (С) — в поле зрения микроскопа между спермиями заметны промежутки;
  • редкая сперма (Р) — спермии размещаются в поле зрения микроскопа с большими незаполненными промежутками.
Определение качества спермы в лаборатории «Свердловской» птицефабрики

Рис. 9.20. Определение качества спермы в лаборатории «Свердловской» птицефабрики

Активность спермиев. Активность (подвижность) спермиев оценивают по десятибалльной шкале: 10 баллов — сперма, в которой все спермии имеют прямолинейно-поступательное движение. Однако практически такое явление маловероятно, так как в каждом эякуляте есть спермии различного возраста, степени зрелости, возбудимости и подвижности. Поэтому реальной высокой оценкой подвижности считают 9 баллов (9 спермиев из 10 имеют прямолинейно-поступательное движение). Минимальной оценкой (1 балл) характеризуется сперма с самой низкой подвижностью спермиев (1 спермий из 10 двигается прямолинейно-поступательно). Поступательные движения единичных спермиев обозначают ЕД, колебательные — КД; неподвижность всех спермиев — Н (некроспермия), полное отсутствие спермиев в сперме — А (азоспермия).

Для визуального определения густоты спермиев на предметное стекло наносят каплю спермы таких размеров, чтобы она заполнила все пространство под покровным стеклом, но не вытекала из-под него. При такой оценке сперму петухов считают густой (Г), когда все поле зрения микроскопа заполнено спермиями в количестве от 4 до 6 млрд/мл. Средней (С) по густоте считается сперма, в которой между спермиями имеются уже промежутки, а число спермиев в ней колеблется от 2 до 4 млрд/мл. В редкой (Р) сперме спермин отделены друг от друга большими промежутками, а концентрация их при этом равна 0,5—2 млрд/мл. Для осеменения такая сперма непригодна.

Для оценки индивидуальных свойств спермы петухов и расчета ее разбавления необходимо знать концентрацию спермиев. Единственный прямой метод ее определения — на гемоцитометре. Однако это очень скучная и утомительная процедура, поэтому она используется только для калибровки других, косвенных методов. Такие косвенные методы могут включать колориметрический анализ, определение мутности, а все они для применения на практике нуждаются в коррекции или калибровке. В зависимости от требуемой степени точности можно использовать те или иные опубликованные калибровочные кривые, которые позволяют определить приблизительное соответствие между показаниями косвенного метода и данных прямого измерения на гемоцитометре. Для получения наиболее точных данных каждый прибор для косвенного измерения должен один раз в год калиброваться с помощью серии стандартных разбавленных образцов спермы с известной концентрацией.

Точнее определить концентрацию спермиев можно с помощью счетной камеры.

Концентрация спермиев. Сперма птиц очень густая. Ее концентрацию выражают числом спермиев в 1 мл (1 см3) в миллиардах и обозначают буквой С. Между концентрацией спермиев и оплодотворяющей способностью спермы установлена прямая положительная корреляция порядка 0,3—0,4. Концентрацию спермиев определяют в счетных камерах или на фотоэлектроколориметре. Подсчет количества спермиев в счетной камере Горяева проводят по общепринятой методике при увеличении 400 раз. В эритроцитный меланжер набирают сперму до деления 0,5; 3%-й раствор хлористого натрия набирают до деления 101. Концентрацию вычисляют по формуле

С = «/100,

где С — концентрация спермиев (млрд/мл); п — число спермиев в пяти больших квадратах.

Подсчет концентрации спермиев в камере Горяева трудоемок и длителен. При необходимости оценки большого количества самцов лучше пользоваться фотоэлектроколориметром. Концентрацию спермиев определяют на приборе ФЭК-М по общепринятой методике и в соответствии с прилагаемой к прибору инструкцией. Для этого необходимо предварительно построить калибровочную кривую, изображающую зависимость оптической плотности от концентрации спермиев. С этой целью выбирают несколько эякулятов и тщательно определяют концентрацию спермиев с помощью счетной камеры. Из отобранных эякулятов путем разбавления 3,5%-м раствором лимоннокислого натрия (1 : 1; 1 : 2; 1 : 3) и т.д. готовят образцы спермы (не менее 5—6 эталонов) и уточняют концентрацию спермиев в каждом из них с помощью счетной камеры. Определяют оптическую плотность каждого образца на приборе и, зная фактическую концентрацию спермиев, установленную с помощью счетной камеры, строят калибровочную кривую. Для этого на миллиметровой бумаге откладывают по горизонтальной оси известные концентрации спермиев каждого образца, по вертикальной — соответствующие им величины оптической плотности. В местах пересечения перпендикуляров ставят точки и проводят кривую так, чтобы она прошла через большинство указанных точек, а число точек, лежащих выше и ниже калибровочной кривой, было примерно одинаковым. Для определения концентрации спермиев любого эякулята нужно лишь определить его оптическую плотность на приборе и посмотреть, какой концентрации спермиев соответствует калибровочная кривая.

Оценку спермы птиц по редукции метиленовой сини проводят по методике, применяемой для спермы барана и быка. Сперма петухов хорошего качества обесцвечивает раствор за 3—4 мин.

Определение резистентности спермиев. Резистентность спермы (Р) — показатель устойчивости спермиев к 1%-му раствору хлористого натрия.

Метод определения резистентности основан на растворяющем действии изотонического раствора натрия на липопротеидный покров спермиев. Чем более устойчивы спермин, тем меньшее действие оказывает на них этот раствор, а значит, при большом разведении они сохраняют способность двигаться прямолинейно-поступательно. Резистентность спермы выражается количеством раствора хлористого натрия (мл), необходимого для полного прекращения поступательного движения спермиев. Методика определения резистентности следующая. В три флакона (пенициллиновые) отмеряют при помощи бюретки 1%-й раствор химически чистого хлористого натрия в дистиллированной воде: флакон № 1 — 10, флакон № 2 — 0,5, флакон № 3 — 0,25 мл.

Микропипеткой набирают 0,02 мл спермы и, обтерев кончик пипетки фильтровальной бумагой, вносят сперму во флакон № 1. Этим же раствором смывают из канала пипетки оставшуюся сперму. Круговыми движениями перемешивают содержимое флакона № 1 и просматривают каплю под микроскопом без покровного стекла. Если все спермии неподвижны, то резистентность испытываемой спермы менее 500. Если же поступательное движение спермиев продолжается, то градуированной пипеткой отмеряют 0,5 мл содержимого флакона № 1 и переносят во флакон № 2.

Содержимое флакона № 2 перемешивают круговыми движениями, выдерживают в течение 3 мин и исследуют его каплю под микроскопом. Если все спермии погибли, значит, резистентность равна 1000. Если обнаружено поступательное движение спермиев, то из флакона № 2 отмеряют 0,25 мл раствора и переносят во флакон № 3, перемешивают и после 3-минутной выдержки исследуют под микроскопом. Гибель спермиев указывает на резистентность, равную 2000. При наличии во флаконе № 3 спермиев с поступательным движением добавляют из бюретки 1%-й раствор хлористого натрия по 0,5 мл и после каждой прибавки содержимое флакона № 3 снова перемешивают, а каплю исследуют под микроскопом. Такие действия осуществляют до прекращения спермиями прямолинейно-поступательных движений.

Определение переживаемости спермиев вне организма. Один из важнейших показателей качества полученной спермы — активность спермиев. Определение переживаемости спермиев вне организма может служить дополнительным значительным критерием их оплодотворяющей способности. Чем дольше спермии сохраняют живучесть в пробирке, тем выше их устойчивость к внешним воздействиям. Выживаемость спермиев снижается в результате плохого кормления и содержания самцов, при попадании в сперму воды, медикаментов, грязи, а также при ее резком охлаждении.

Для определения переживаемости спермы птиц наиболее удобны следующие температурные режимы хранения: 2—5°С и 48,5°С. В первом случае переживаемость определяется в наиболее благоприятных условиях хранения спермы — за счет снижения обменных процессов, при котором заторможены распад запасных веществ и накопление ядовитых продуктов обмена. При температуре 2—5°С сперма птиц переживает до 13 сут.

Во втором случае переживаемость определяется повышением температуры (48,5°С), когда ускоряется движение спермиев, возрастает расход энергии, происходит их самоотравление ядовитыми продуктами обмена. Кроме того, температура 48,5°С является промежуточной между 41,7°С и 55°С, первая из которых характерна для нормальной жизнедеятельности клеток, а вторая — для начала необратимой денатурации клеточных белков с их последующей коагуляцией. Поэтому переживаемость спермиев при этой температуре — своеобразная проба их последующей жизнеспособности. При температуре 48,5°С срок жизни спермиев сокращается до 1—2 ч.

Объективное измерение подвижности спермиев можно проводить с помощью специальной поточной камеры, устанавливаемой в спектрофотометр. Спермии будут «плыть» против течения, при этом живые спермии станут выстраиваться против течения головками. Поскольку они длинные и тонкие, такая ориентация в потоке влияет на прохождение через него света. Чем выше процент живых спермиев в образце, тем меньше света проникает через поток. Подвижность и метаболизм спермиев можно также оценить с помощью колориметрии. Образец спермы с красителем (тетразолиум) инкубируется в течение 10 мин, за это время спермии выделяют химические вещества, которые влияют на окрашивание. Изменения окрашивания можно фиксировать визуально или спектрофотометрически с предварительным центрифугированием — этот метод часто используется для оценки спермы петухов. В последние годы возник интерес к определению способности спермиев проникать через перивител-линовую мембрану, выделенную из обычных яиц, а также к оценке петухов по этому критерию. Мембрана аккуратно снимается с желтка яйца и режется на квадратные кусочки размером 0,5 х 0,5 см, которые затем инкубируются с образцами спермы концентрацией примерно 107 в течение 10 мин при 40°С. Под микроскопом ясно различимы отверстия от проникновения спермиев через мембрану, а их число напрямую связано с подвижностью/метаболизмом спермиев и общей плодовитостью петухов. В области зародышевого диска можно насчитать до 40—60 отверстий на 1 мм2, тогда как в других зонах их число составляет всего 5—10.

Определение переживаемости спермиев при температуре 2—5°С. В пенициллиновые флаконы отмеряют градуированной пипеткой по 0,2 мл цельной свежей или разбавленной спермы. Флаконы со спермой закрывают пробками, выдерживают при комнатной температуре в течение 2—3 мин, а затем помещают в холодильник (температура 2—5°С). Оценку активности спермиев проводят при температуре 40 и 42°С через 0, 24, 48, 72 и более часов хранения. Для этого на предметное стекло наносят каплю спермы, рядом с ней вдвое большую каплю 4%-го раствора лимоннокислого натрия. Обе капли накрывают покровным стеклом и наблюдают за подвижностью спермиев в течение 1—2 мин. Подвижность оценивают по 10-балльной шкале в месте слияния капли спермы с раствором лимоннокислого натрия. Продолжительность переживаемости спермиев устанавливают в часах или сутках, т.е. определяют число часов от начала наблюдения до полной неподвижности всех спермиев за вычетом половины времени между предпоследним и последним наблюдением, поскольку неизвестно время прекращения поступательных движений спермиев. Абсолютный показатель переживаемости вычисляют следующим образом: сначала складывают баллы двух смежных оценок и сумму делят пополам, получая средние оценки подвижности для каждого промежутка времени между просмотрами. Затем полученные средние оценки умножают на число часов между просмотрами и произведения суммируют.

Так как действительное время прекращения движения спермиев неизвестно, среднюю оценку за данный промежуток времени умножают на 12, а не на 24 ч.

Определение переживаемости спермиев при температуре 48,5°С. В пенициллиновые флаконы градуированной пипеткой отмеряют по 0,2 мл свежей спермы или спермы, разбавленной 1:1.

Флаконы со спермой плотно закрывают пробками и помещают в суховоздушный электрический термостат с автоматическим поддержанием температуры 48,5°С. Оценку активности спермиев производят под микроскопом по 10-балльной шкале при температуре 42°С без подщелачивания цитратом натрия с использованием столика Морозова. Первую оценку производят через 30 мин, затем через каждые 10 мин до полной гибели спермиев. Переживаемость выражают в минутах от начала наблюдения до момента полной гибели спермиев.

Определение окислительно-восстановительных свойств спермы. Свежеполученная сперма птиц имеет нейтральную реакцию (pH 7). Незначительное увеличение кислотности (pH < 6) замедляет движение спермиев, но не убивает их. При pH > 8 (щелочная реакция) наблюдаются ускорение движения спермиев и их быстрая гибель.

Концентрацию водородных ионов измеряют при помощи универсальной индикаторной бумаги (pH от 1 до 10) или специального прибора ЛПУ-01.

Оценка спермы по редукции метиленовой сини. Существует тесная взаимосвязь между дыхательной активностью спермы и ее оплодотворяющей способностью. Интенсивность дыхания спермы определяют по времени обесцвечивания 0,01 %-го раствора метиленовой сини, которое наступает после израсходования кислорода, находящегося в сперме. Сперма хорошего качества значительно быстрее обесцвечивает раствор метиленовой сини (петухов — за 3—4, индюков — за 4—5, гусаков — за 7—9 мин).

Необходимый раствор метиленовой сини (0,01%-й) готовят следующим образом. Берут 200 мл 1%-го раствора хлористого натрия. В него добавляют 0,5 г метиленовой сини. Полученный раствор сохраняют в течение трех дней при температуре 25—30°С в стеклянной колбе № 1 с притертой пробкой. Далее в колбу № 2 наливают 90 мл 1%-го раствора хлористого натрия, а из колбы № 1 добавляют 10 мл раствора метиленовой сини, после чего все тщательно взбалтывают. Затем в колбу № 3 наливают 40 мл раствора из колбы № 2 и добавляют 60 мл раствора хлористого натрия, все взбалтывают. Таким образом, в колбе № 3 получают 0,01%-й рабочий раствор метиленовой сини, который применяют для определения дыхания спермиев

Определение дыхания спермиев. На предметное стекло наносят каплю свежей неразбавленной спермы и каплю 0,01 %-го раствора метиленовой сини. Обе капли смешивают стеклянной трубочкой (внутренний диаметр — 0,8—1 мм) и всасывают смесь, чтобы в канале трубки получился столбик длиной около 2 см. При всасывании смеси необходимо следить за тем, чтобы в пробу не попали пузырьки воздуха, так как это приводит к ошибочным выводам. Затем трубку со смесью кладут на белую бумагу горизонтально и держат при температуре 18—22°С, отмечая время, в течение которого сперма обесцветит раствор.

Оценка спермиев по активности дегидрогеназ. Особенности обменных процессов и подвижности спермиев обусловлены активностью ряда ферментов. Главное место в метаболизме спермы занимают окислительно-восстановительные ферменты — дегидрогеназы. Активность дегидрогеназ спермы положительно коррелирует с концентрацией спермиев и их подвижностью, способностью сохраняться при низких температурах, т.е. может служить качественной характеристикой спермы — ее оплодотворяющей способности.

Методика определения активности дегидрогеназ по Семакову (в модификации М.С. Ворониной для спермы петухов). Для определения дегидрогеназной активности спермы птицы используют 0,2%-й 2-, 3-, 5-трифенилтетразолий хлорида на буферном растворе с pH 7,4. Фосфатный буфер готовят из первичного фосфата калия (9,078 г реактива и доливают до 1 л воды) и вторичного фосфата натрия (11,876 г реактива и доливают до 1 л воды). Реактивы предварительно должны быть высушены в эксикаторе над хлоридом кальция. Для получения буфера с pH 7,4 берут 1,92 мл первичного фосфата калия и 8,08 мл вторичного фосфата натрия. Буфер всегда готовят в день его использования.

Для исследования берут 0,1 мл неразбавленной спермы, наливают ее в центрифужную пробирку, добавляют 0,25 мл 0,2%-го раствора 2-, 3-, 5-трифенилтетразолия хлорида на буферном растворе с pH 7,4 (раствор тетразолия и пробирки предварительно должны быть подогреты в термостате при температуре 38—40°С). Затем содержимое пробирки тщательно перемешивают, плотно закрывают пробкой и ставят на водяную баню при температуре 38—40°С. Этот препарат в присутствии подвижных спермиев при температуре 38—40°С восстанавливается в красный формазан, что придает пробе красную окраску. В качестве контроля используют 0,25 мл 0,2%-го раствора тетразолия в пробирке, которую ставят на водяную баню. Время от начала установки пробы на водяную баню или ультратермостат до появления розовой окраски и является показателем активности дегидрогеназ: чем дольше не появляется окраска, тем ниже активность, и наоборот.

Активность дегидрогеназ в большой степени зависит от концентрации спермиев в сперме. Для сравнения активности дегидрогеназ спермы разных эякулятов вводят поправку на концентрацию спермиев, т.е. время, прошедшее до появления окраски (мин), умножают на коэффициент, показывающий, во сколько раз концентрация спермиев в пробе спермы превышает стандарт (принятый стандарт — 1 млрд спермиев в 1 мл спермы). Например, если проба спермы с содержанием в 1 мл 2,5 млрд спермиев окрасилась за 10 мин, то истинная активность дегидрогеназ составляет 25 мин (10 • 2,5 = 25).

Высокой подвижностью, переживаемостью и оплодотворяющей способностью характеризуется сперма петухов с высокой и средней активностью дегидрогеназ (в пределах 18—30 мин).

Санитарная оценка технологических процессов на племенных предприятиях (станциях) и пунктах осеменения. При несоблюдении ветеринарно-санитарных условий микроорганизмы, попав в сперму, могут понижать выживаемость спермиев, оплодотворяемость самок, вызывать аборты, гибель молодняка в неонатальный период, заболевания половых органов самок, также они являются источником возникновения и распространения различных инфекционных заболеваний (бруцеллеза, туберкулеза, паратифозного аборта, лептоспи-роза, пустулезного вульвовагинита, эпизоотического аборта крупного рогатого скота, ящура, заболевания Бордера овец, трихомсамо-ноза, вибриоза, токсоплазмоза и др.). Необходимо учитывать, что выделение возбудителей со спермой возможно только в особых обстоятельствах. При диагностике важно иметь в виду, что у производителей может наблюдаться острая форма, вызывающая патологию половых органов даже при отрицательных показателях крови.

Загрязнение спермы условно-патогенной микрофлорой (стафилококком, стрептококками, синегнойной и кишечной палочкой, протеем и др.) снижают ее качество на 8—75%, а оплодотворяемость на 3—22%. Применение спермы с синегнойной палочкой на 12% увеличивает число гинекологических заболеваний.

В санитарную оценку технологических процессов на племенных предприятиях и пунктах входят:

  • • исследование коли-титра спермы и смывов с препуция;
  • • определение микробной и грибковой загрязненности спермы и препуция;
  • • определение стерильности синтетических сред, используемых для разбавления спермы;
  • • бактериологический контроль подготовки приборов и инструментов для получения и введения спермы;
  • • определение микробной и грибковой загрязненности воздуха помещений станций и пунктов искусственного осеменения, лабораторий, манежей, хранилищ спермы и помещений для производителей.

В связи с этим необходимо овладеть методиками взятия слизи и смывов препуция, бактериологического исследования спермы, слизи и смывов препуция и инструментов, получения синтетических сред для разбавления спермы и воздуха помещений.

Приборный метод. Необходимость объективного определения характеристик сперматозоидов привела к созданию различных методических подходов и устройств, позволяющих вычислять их подвижность и концентрацию. Среди них — имеющие приоритетное исследовательское значение компьютерные системы анализа фертильности семени, включающие микроскоп и видеокамеру с цифровой обработкой изображений. Развитие оптических методов позволило создать новые подходы к оценке характеристик подвижности сперматозоидов. Для определения основных показателей фертильности спермы человека был разработан принципиально новый прибор 5734-500, который позволяет измерять концентрацию, суммарную подвижность, количество активно подвижных и среднюю скорость сперматозоидов (Габбасов З.А., 1999). Существует множество анализаторов спермы быков-производителей импортного производства, например, 8()А-УЬ МЕБ(Израиль), АпёгоУтоп Минитюб (Германия), которые имеют существенный недостаток по сравнению с отечественным ,5774-500 (НПФ «Биола», Россия) — это высокая цена.

В качестве нового приема в сравнительном аспекте использовали отечественный спермоанализатор 5774-500 с модификацией его функции для применения к быкам-производителям. Эта разработка позволила наиболее точно оценить и исключить влияние человеческого фактора при визуальном контроле качества семени. Работа осуществлялась по принципу лазерного анализа частотного спектра флуктуаций оптической плотности образца сперматозоидов, вызванных их движением через оптический канал со специальными характеристиками.

Хорошо перемешанную пробу с помощью микропипетки объемом 50 мкл помещали в специальную стеклянную камеру, где под действием капиллярных сил она заполняла рабочий объем. При движении сперматозоидов в камере возникали периодические колебания оптической плотности частой, соответствующей скорости перемещения клеток и периоду модуляции интенсивности света (рис. 9.21). Колебания интенсивности света регистрировались фотоприемником, затем поступали в аналогоцифровой преобразователь и далее в компьютер.

Ан алого-

цифровой

преобразователь

Компьютер

Термостатируемое кюветное отделение

Камера

Фотоприемник

Модулятор света Лазер

б)

Рис. 9.21. Прибор 5ГД-500: а — схема прибора; б — камера для анализа спермы

Анализ спермы проводили в специальной камере, температура которой поддерживалась на уровне 38 С. Для свободного движения сперматозоидов и регистрации быстроподвижных клеток глубина камеры была выбрана достаточно большой (200 мкм). Для визуального контроля подвижности в микроскопе спермоанализатора использовалась камера глубиной 20 мкм.

Метод достаточно точен и позволял автоматизировать рутинную работу по оценке нативной и криоконсервированной спермы, отражал основные показатели подвижности и концентрацию сперматозоидов человека. Однако в предлагаемом разработчиками варианте метод не мог быть использован для объективной оценки спермы быков-производителей.

Биологические основы разбавления спермы. Для проведения искусственного осеменения необходимо выполнить ряд действий, направленных на улучшение качественных характеристик биологического материала. Все это достигается разбавлением спермы специальными средами. Помимо защитных функций разбавление спермы облегчает дробление эякулята на порции (спермодозы). (Спермодозы — минимальное количество замороженной спермы.) Это особенно существенно для животных с маточным типом естественного осеменения (свиней, лошадей), поскольку спермодоза должна иметь нормативное число подвижных спермиев и быть достаточно объемной.

При правильном применении разбавителей:

  • 1) получается большой объем спермы, что имеет важное практическое значение для интенсивного использования ценных производителей;
  • 2) в сперме, смешанной с некоторыми разбавителями, спермии переходят из активного в анабиотическое состояние;
  • 3) удлиняется срок переживаемости спермиев вне организма вследствие замены секретов придаточных половых желез искусственной средой, ослабления концентрации в сперме токсических веществ, бактериостатического действия добавляемых в разбавитель антибиотиков, антисептиков и других веществ.

Впервые для разбавления спермы И.И. Иванов использовал физиологический раствор хлорида натрия. Однако обычный 0,9%-й физиологический раствор оказался малопригодным для разбавления спермы, так как спермии в ней быстро оседают; pH физиологического раствора колеблется в пределах 5,6—6,2 и даже ниже, так как дистиллированная вода поглощает из воздуха углекислоту. Затем предложили готовить физиологический раствор с учетом видовых особенностей спермы — применялся подщелоченный сахаро-физиологический раствор хлорида натрия. Были предложены: ГФО-глю-козо-фосфатный разбавитель для овец; ГСЛ-глюкозо-сульфатный разбавитель для лошадей; ГТС-глюкозо-тартатный разбавитель для

свиней; ГТКр-глюкозо-тартатный разбавитель для кроликов; ГТСо-глюкозо-тартатный разбавитель для собак, желатинированный и другие разбавители.

К.Н. Кржишковский и Г.П. Павлов (1927) установили важность для увеличения переживания спермиев включения в разбавитель лецитина и желтка куриного яйца. На основе этого с первой половины XX в. широкое распространение получили глюкозо-цитратно-жел-точные разбавители.

В настоящее время для разбавления спермы применяют синтетические и биологические среды. Сахара (глюкоза, фруктоза, лактоза, сахароза) или гликокол (аминоуксусная кислота) снижают электропроводность раствора, т.е. нейтрализуют вредное действие на спермиев электролитов, защищают их от снятия электрического заряда (не допускают агглютинации). Наряду с этим сахара используются спермиями как источник энергии для дыхания и гликолиза. Вторым компонентом среды являются соли многоосновных кислот, например, натрий лимоннокислый трехзамещенный пятиводный (цитрат), и сульфаты. Они защищают спермии от самоотравления кислыми продуктами распада, способствуют уплотнению коллоидов поверхностных слоев цитоплазмы спермиев и создают буферность среды. Лимоннокислый натрий имеет pH 7,8—8,0 и является естественным буфером. Поскольку в сыворотке спермы жеребца и хряка содержится много солей, в разбавитель для их спермы лимоннокислый натрий не вводят или добавляют в очень незначительном количестве. Для понижения содержания в сперме кальция и магния, избыток которых усиливает агглютинацию спермиев, в состав некоторых сред вводят натриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (хелатон). Эта соль временно связывает ионы металлов, тормозит активность ферментов, понижает обмен веществ в сперме и тем самым способствует лучшей выживаемости спермиев без применения хладагентов. Третьим компонентом среды является яичный желток, в котором содержится до 7% лецитина — жироподобного вещества. Лецитин одновременно является питательным веществом, предохраняющим расходование липидов цитоплазмы спермиев. Использование для разбавления спермы желтка позволяет смягчить температурный шок спермиев при охлаждении спермы, кроме того, он обладает буферными свойствами. В желтке яйца содержатся полный набор незаменимых аминокислот, углеводы, жироподобные вещества, пигменты, микроэлементы, витамины, которые также служат источником питания.

В качестве дополнительных компонентов для синтетических сред используют сульфаниламид (белый стрептоцид), антибиотики (пенициллин, стрептомицин), а также витамин В|2, глицерин и др.

Сульфаниламид и антибиотики вводят в среду для предупреждения развития микроорганизмов, которые попадают в сперму. Витамин Вр усиливает действие антибиотиков. Глицерин используют в синтетических средах при замораживании спермы. В присутствии глицерина замерзание воды в синтетической среде происходит без образования крупных кристаллов, которые могут повреждать спермии.

Хорошим разбавителем для спермы быка, жеребца, хряка и других производителей является свежее молоко. Н.Н. Михайлов установил, что молочный разбавитель обладает большой буферностъю, понижает степень раздражения спермиев, увеличивает вязкость разбавленной спермы и имеет концентрацию водородных ионов (pH), сходную с маточной слизью. Молоко является самой биологически полноценной средой для спермиев, поэтому сперму им можно разбавлять без опасения. Молочный разбавитель повышает пережива-емость спермы, ее оплодотворяющую способность, которая при температуре 0°С сохраняется до семи суток. Поэтому оплодотворяемость коров, кобыл при применении молочного разбавителя выше, чем при употреблении желточно-цитратных разбавителей. В качестве разбавителя можно применять и сухое молоко в количестве 10 г на 100 мл дистиллированной воды (Г. В. Зверева). Разбавитель из сухого молока широко применяется в Англии.

Для осеменении свиней фракционным методом А. В. Квасницкий предложил ряд разбавителей, назначение которых — заполнить полости рогов матки, поэтому их называют заполнителями. Среди заполнителей известны: 1) глюкозо-солевой (30 г глюкозы и 4,5 г поваренной соли на 1 л дистиллированной воды); 2) солевой (9 г поваренной соли на 1 л дистиллированной воды); 3) молочный (свежий обрат коровьего молока).

Эти заполнители оказывают на слизистую оболочку матки более благоприятное действие, чем желточно-цитратные и другие разбавители.

В Болгарии широко применяют медовый разбавитель для спермы жеребца, быка и барана. Братанов, Иосифов, Стоянов установили, что 7%-й водный раствор меда очень благоприятно действует на спермии. Добавление в разбавители для спермы быка и барана фосфатов и сульфатов улучшает их качество. Авторы не рекомендуют пользоваться медом с горьким вкусом.

Все компоненты для приготовления разбавителей должны быть химически чистыми, проверенными на токсичность и соответствовать ГОСТу, указанному в инструкции по искусственному осеменению.

Оптимальные степени разбавления спермы. Перед разбавлением эякулята нужно узнать активность и концентрацию спермиев. Эти показатели должны удовлетворять требованиям инструкции, поскольку являются основой для определения степени разбавления. Степень разбавления зависит также от необходимого количества доз и других условий. Эякулят разбавляют, добавляя по частям необходимое количество разбавителя и тщательно перемешивая жидкость. Обычно сперму быка разбавляют в 10 (1 : 9) — 15 (1 : 14) раз. В Италии и Англии сперму разбавляют 1 : 20, в Германии — 1 : 25. Некоторые специалисты рекомендуют разбавлять сперму быка 1 : 100 и даже 1 : 200. Такое различие в степени разбавления объясняется разным подходом к определению количества спермиев, необходимого для оплодотворения. Одни авторы считают, что в дозе для осеменения одной коровы должно быть минимум 10—15 млн спермиев, другие — 50—100 млн.

Биологический контроль сред. Качество синтетической среды определяют биологическим путем — по длительной выживаемости спермиев в присутствии различных разбавителей спермы, сохраняемой при температуре 2—4°С. Необходимо проводить биоконтроль каждой вновь поступившей серии компонентов, входящих в состав синтетической среды. Биоконтроль позволяет установить оптимальные и токсические степени разбавления спермы. Оптимальную степень разбавления спермы определяют по наибольшему показателю абсолютной живучести (выживаемости) спермиев.

Техника разбавления спермы производителей синтетическими средами. Разбавление спермы производят после ее оценки. Работу по разбавлению спермы проводят в специальной стерильной камере, или в лаборатории, облученной бактериопидными лампами БУВ-30 или БУВ-60, или в настольном боксе с бактериопидными лампами. Количество ламп устанавливают из расчета 1 Вт на 1 м3 помещения. Если сперма быка соответствует требованию ГОСТ 23745-79 (активность спермиев не менее 8 баллов и концентрация 800 млн/мл), его разбавляют.

Объем эякулята в одноразовом полиэтиленовом спермоприем-нике определяют путем его взвешивания на весах типа ВЛК-20, ВЛК-500 или Р-2-200, зная заранее стандартную массу отделенной части спермоприемника (масса 1 мл спермы примерно 1 г), или устанавливают в стандартном смесителе спермы, сливая в него все полученные эякуляты.

Годную сперму разбавляют в спермоприемнике или смесителе 1 : 1 средой, температура которой 27 + ГС. Для этой цели теплым (27 + ГС) стерильным шприцем набирают среду, стерильной иглой прокалывают полиэтиленовый спермоприемник (место прокалывания обрабатывают спиртовым тампоном) и добавляют необходимое количество среды, которая должна стекать по его стенке (табл. 9.4).

Состав сред для хранения спермы при температуре 2-5°С, г

(по А.М. Петрову)

Компонент

Бык

Баран

Жеребец

ГЦЖ

ггхцж

гхцж

с аргинином

ГЦЖ

ггцж

лхцж

Глюкоза безводная

3,0

1,26

3,0

0,8

Лактоза

11,0

Натрий лимоннокислый

1,4

1,54

1,16

2,8

2,71

0,089

Гл и ко кол

0,5

Трилон Б

0,14

0,1

Аргинин солянокислый

0,17

Желток куриных ЯИЦ

12

8-10

20

15

15

1,6-2,0

Натрий двууглекислый

0,008

Спермосан ППК

75 тыс. НЕ

75 тыс. НЕ

75 тыс. НЕ

100 тыс. НЕ

100 тыс. НЕ

20-30 тыс. ИЕ

Вода дистиллированная

100

100

100

100

100

100

После 15—20 мин выдержки при комнатной температуре разбавленные эякуляты одного быка смешивают в градуированном смесителе или в градуированном стаканчике и проводят вторичное разбавление средой комнатной температуры (18—20°С). Среду небольшими порциями вводят по стенке смесителя или спермоприемника и перемешивают после добавления каждой порции среды.

Сперму разбавляют так, чтобы в одной соломинке после оттаивания подвижных спермиев (с прямолинейно-поступательным движением) их было не менее 15 млн.

Чтобы избежать неодинакового количества спермиев в отдельных соломинках, необходимо сперму после ее второго разбавления перед расфасовкой размешать стерильным наконечником, соединенным с поливинилхлоридной трубкой или стерильной стеклянной палочкой.

Для разбавления используют только густую сперму барана активностью спермиев не ниже 9 баллов. Разбавляют сперму в 2 (1 : 1) — 4(1 : 3) раза, достигая концентрации спермиев в дозе не менее 80 млн.

Сперму хряка с активностью спермиев не ниже 8 баллов и их концентрацией в 1 мл не менее 100 млн разбавляют в 2 (1 : 1) — 10(1 : 9) раз. Получаемая концентрация спермиев в дозе — не менее 3 млрд через 30—60 мин после взятия спермы и определения ее качества.

Используют сперму жеребца активностью не менее 6 баллов и концентрацией не менее 150 млн спермиев в 1 мл спермы. Разбавляют ее в 3 (1 : 2) — 4 (1 : 3) раза, получая дозы с концентрацией не менее 3 млрд спермиев.

Хранение спермы. При длительном сохранении жизнедеятельности спермиев вне организма животного можно шире применять искусственное осеменение большого поголовья самок за счет возможности перевозки спермы на различные расстояния в любое время года.

Изучение физиологических свойств спермиев показало, что сохранение спермы вне организма животного и ее эффективное использование возможны при соблюдении двух условий.

  • 1. Сохранять сперму при неактивном состоянии спермиев. Чем меньше активность спермиев, тем длительнее можно хранить сперму. Уменьшать активность спермиев удается: а) понижая температуру; б) создавая условия, угнетающие обмен веществ спермиев (кислая среда, добавление хелатона); в) разводя секреты придаточных половых желез растворами, не возбуждающими спермиев и не разрушающими их липопротеидного покрова.
  • 2. Предотвращение интоксикации спермиев бактериотоксинами и бактериолизинами. Для этого необходимо получать сперму наиболее чистой и смешивать ее с разбавителями.

При выборе способов хранения спермы необходимо учитывать ее видовые особенности. Сперма животных с влагалищным типом естественного осеменения (бык, баран) более устойчива во внешней среде по сравнению со спермой животных с маточным типом естественного осеменения (жеребец, хряк).

Каким бы методом ни хранилась сперма, одним из основных условий ее хранения является перевод спермиев в анабиотическое состояние. Известно, что в организме жизнеспособность спермиев может сохраняться довольно долго. Следовательно, при создании соответствующих условий сперму можно хранить и вне организма при плюсовой температуре. В решении этой задачи уже сделаны первые шаги. Лабораторные исследования и практика показали, что надежным регулятором скорости обмена веществ в сперме является температура. Существует несколько методов хранения спермы: кратковременное хранение спермы быков, баранов, хряков и жеребцов при температуре 2—4°С или комнатной температуре; длительное хранение спермы быков и жеребцов в жидком азоте.

Кратковременное хранение спермы быков-, баранов-, хряков- и же-ребцов-производителей при температуре, близкой к 0°С (2—5°С), или при температуре 16—20°С. Температура, близкая к 0°С, значительно удлиняет переживаемоеть спермиев и замедляет обменные процессы; дыхание и фруктолиз спермиев быка и барана тормозятся в 20— 25 раз по сравнению с интенсивностью этих процессов при температуре тела животных.

Для охлаждения спермы используют холодильники, холодильные шкафы или термосы различной конструкции, в которых сохраняется температура 2—4°С. В производственных условиях для хранения спермы при температуре 2—4°С пользуются термосами, сконструированными специально для искусственного осеменения.

Хранение спермы быка и барана при температуре 2—4°С. Свежепо-лученную сперму быков или баранов после оценки ее качества разбавляют, снова проверяют под микроскопом на активность спермиев и затем расфасовывают. Сперму быков расфасовывают в одноразовые стерильные или полиэтиленовые ампулы, полиэтиленовые пробирки вместимостью 1 мл, а также во флаконы из-под пенициллина. Сперму баранов расфасовывают в пробирки вместимостью 5—8 мл или в небольшие флаконы (инсулиновые). Пробирки или флаконы заполняют спермой до самой пробки во избежание взбалтывания при транспортировке, неблагоприятно влияющего на выживаемость спермиев. После наполнения спермой концы стеклянных ампул запаивают на некоптящем пламени, а у полиэтиленовых ампул запаивают конец с помощью электропаяльника. Флаконы закрывают стерильной нетоксичной пробкой и резиновым колечком фиксируют этикетку.

Хранение спермы хряка при температуре 16—20°С. Сперму, разбавленную глкжозо-хелато-цитратно-сульфатной или глюкозо-хелато-цитратной средами, хранят в закрытых стеклянных колбах или полиэтиленовых флаконах в темном месте. Транспортируют ее в термосах различных конструкций (модель «Харьков ТС-3», поролоновый термос, термос-ящик и др.) или в бытовых сумках-холодильниках (рис. 9.22).

Поролоновый термос для транспортировки спермы хряка и набор полиэтиленовых инструментов для осеменения свиноматок

Рис. 9.22. Поролоновый термос для транспортировки спермы хряка и набор полиэтиленовых инструментов для осеменения свиноматок

Температура хранения разбавленной спермы должна составлять 16—20°С. Для транспортировки колбы со спермой плотно закрывают пергаментной бумагой или целлоидином. После доставки спермы на место ее хранения в негерметично закрытых колбах или флаконах ее не менее двух раз в сутки осторожно перемешивают. Сперму, разбавленную ГХЦС (или ГХЦ), можно транспортировать через 30 мин после разбавления. Сперму хряков, хранившуюся при плюсовых температурах, используют для осеменения свиноматок в течение трех суток при активности спермиев не ниже 6 баллов.

Хранение спермы жеребца при температуре 2—4°С. Сперму жеребца после разбавления и повторной проверки на активность спермиев расфасовывают в стерильные стеклянные баночки с притертыми пробками вместимостью 50—100 мл. Пробки закрепляют резиновым кольцом, баночку со спермой помещают в трехслойный марлевый или полиэтиленовый мешочек и кладут в термос со льдом. Для хранения и перевозки спермы используют термос конструкции Российского научно-исследовательского института коневодства. Этот термос состоит из оцинкованного железного бачка и двухстенного теплоизоляционного фанерного ящика с крышкой. В бачке по бокам расположены две емкости, которые загружают льдом, а по середине — емкость цилиндрической формы для баночек со спермой, в которой поддерживается температура 2—4°С. Сперму жеребца, хранившуюся при температуре 2—4°С, используют для осеменения кобыл в течение 24—36 ч.

Долговременное хранение спермы и технология низкотемпературного замораживания. Транспортировка спермы. В настоящее время широкое применение нашел метод замораживания и длительного хранения спермы быков и жеребцов в жидком азоте (-196°С). При этом методе хранения спермии находятся в условиях полного анабиоза, когда сильно замедляются все биохимические процессы. Научными исследованиями установлена способность спермиев переносить низкотемпературное замораживание. Наиболее опасной для живых клеток и тканей температурной зоной является интервал от 0 до -30°С. В этом интервале образование и рост кристаллов льда происходят с наибольшей интенсивностью, что приводит к быстрой гибели (повреждение) клеток.

Таким образом, при сверхбыстром замораживании спермы до температур -79, -183 и -196°С благодаря явлению витрификации можно длительное время сохранять ее оплодотворяющую способность и после оттаивания и искусственного осеменения самок получать нормально развитое потомство сельскохозяйственных животных.

Для снижения опасности кристаллизации воды в спермиях в сперму добавляют растворы криопротекторов.

Метод длительного хранения спермы производителей в замороженном состоянии имеет ряд преимуществ по сравнению с краткосрочным хранением, которое не позволяет регулярно использовать быков с полной нагрузкой. Благодаря этому методу племенные предприятия могут получать сперму от быков на протяжении всего года, хранить ее месяцами и даже годами и создавать большие запасы. Замороженная сперма элитных производителей может быть использована по селекционному плану на большом поголовье. При получении спермы от быка 2 раза в неделю можно собрать за год не менее 200 полноценных эякулятов, или 800—1000 мл спермы, которой после разбавления можно осеменить до 10 тыс. коров вместо 1000— 1500 при использовании других способов хранения спермы.

Внедрение метода длительного хранения спермы в замороженном состоянии позволяет коренным образом изменить организацию племенной работы и осеменения животных. Вместо доставки спермы на пункты по осеменению животных через 2—3 сут, как это принято при других способах хранения, можно создать годовой запас спермы. Имея на пункте необходимый запас спермы разных быков, можно осеменять коров только спермой тех производителей, которые закреплены за стадом по селекционному плану. Замороженную сперму можно использовать на 100%, тогда как сохраняемую при температуре 2—4°С — только на 50—70%. Метод длительного хранения замороженной спермы в 6—7 раз сокращает транспортные расходы.

Применение замороженной спермы дает большой экономический эффект, так как позволяет изъять малоценных и максимально использовать высокоценных быков-производителей и расширить зону действия племенных предприятий и число обслуживаемых животных (до 300—500 тыс. коров и телок в год). Быков-производителей можно использовать независимо от их местонахождения, широко применяя обмен спермой производителей как внутри страны, а также между странами.

Для перевозки спермы в жидком азоте (-196°С) применяют специальные стальные и алюминиевые двустенные сосуды с вакуумнопорошковой либо многослойно-вакуумной изоляцией. Вместимость сосудов — от 4 до 50 л жидкого азота (АТ-6, СДС-20, «Харьков-30» и «Харьков-34А»), Суточный расход жидкого азота в них колеблется от 1 до 3% в зависимости от размеров и качества изоляции.

Хранится сперма на племенных предприятиях в стационарных хранилищах и емкостях (типа ХБ-0,5 ХВ-6202 и др.), в специально закрывающихся канистрах или пластмассовых стаканах, которые должны быть погружены в жидкий азот. Канистры или стаканы имеют съемные перегородки, поэтому в них можно сделать до четырех отделений и хранить несколько эякулятов. Заполненные стаканы помещают один на другой в металлический футляр. На верхнем крае стакана имеется держатель, к которому прикрепляют этикетку с номером быка или номером футляра.

Способ замораживания спермы быков-производителей в соломинках по литовской технологии. При использовании такого способа разбавленную сперму расфасовывают в стерильные полипропиленовые соломинки по 0,25 мл. На каждой соломинке маркировочной машиной М6-ММС делают надписи с помощью сменяемого клише, изготовленного для каждого быка на барабане машины. Соломинки маркируют специальной краской СВКФ-01, в которую добавляют 4% нафтенатно-кобальтового сиккатива и перемешивают. На поверхности соломинок печатается наименование племенного предприятия, кличка и инвентарный номер быка, дата замораживания спермы, а при необходимости другие данные. После работы с машины краску удаляют смесью уайт-спирита и ацетона (3 : 1).

Маркированные соломинки в коробке помещают в настольную бактериоцидную камеру УНБК-1 или другую камеру подобного назначения, включают бактериоцидные лампы и облучают соломинки в течение 4 ч. В стерильной камере соломинки хранятся до их использования.

После второго (окончательного) разбавления спермы ее расфасовывают в стерильные и безвредные для спермиев литовские соломинки (с наружным диаметром 2,5 мм, длиной 100 мм и вместимостью 0,25 мл) и укупоривают окрашенными стеклянными шариками на машине М6-МУ2-С. Соломинки размещаются в один ряд в металлические рамки до 140 шт. Для раскладки соломинок рамку помещают на раскладную рейку, рукой берут соломинки и быстро их раскладывают. При укупорке соломинок шарик расширяет их концы, поэтому после их раскладки строго в один ряд между ними образуются небольшие промежутки. Это является нормой. Чтобы соломинки в рамке остались на своих местах, сверху их прижимают держателем. Для охлаждения спермы в соломинках заполненные рамки кладут одну на другую. До пяти рамок с соломинками (до 700 шт.) помещают в коробку и ставят в холодильник ХЖС-300, в котором поддерживается температура около 4°С. В один холодильник ставят не более 16 коробок (до 11 200 соломинок). В холодильнике сперма постепенно, равномерно (0,3—0,5°С/мин) в течение 1 ч охлаждается до 4°С. Сперму выдерживают в холодильнике 3—4 ч и затем замораживают.

Современная технология замораживания семени. В настоящее время используют технологию, разработанную во Франции. Процесс замораживания состоит из нескольких этапов. На первом этапе идет расфасовка свежей спермы в соломинки (рис. 9.23). На каждой соломинке указываются название предприятия, кличка быка, его номер, порода и дата заморозки спермы, которая соответствует дате ее взятия. Этот этап автоматизирован. Информация с компьютера из базы данных поступает на станок по расфасовке и маркировке спермы.

В дальнейшем соломинки размещают на специальные рамки. Здесь сперма находится в течение 2—3 ч при температуре 3—5°С. Устанавливается программа постепенного понижения температуры. После охлаждения до температуры 3—5°С сперму помещают в специальные камеры, в которых происходит ее замораживание жидким азотом, сначала до -100°С, а затем до -140°С. После этого сперму помещают в банк хранения, где она находится в жидком азоте.

Метод глубокого замораживания спермы хряков (И.Ш. Шапиев, Л.Г. Мороз, Н.В. Корбан). Этот метод позволяет интенсифицировать селекционный процесс в племенном свиноводстве благодаря широкому обмену генетическими ресурсами наиболее ценных производителей.

Прибор для фасовки и замораживания семени

Рис. 9.23. Прибор для фасовки и замораживания семени

(Дюпон, Франция)

Наиболее результативен метод ВИЖа (60—80% оплодотворенных свиноматок). Согласно этому методу для замораживания используется целый эякулят, поэтому 1 доза замороженной спермы имеет большой объем (100—150 мл), что требует значительных затрат хладагента и емкостей для ее хранения. Кроме того, многие исследователи отмечают большую вариабельность в оплодотворяемости свиноматок при осеменении замороженно-оттаянной спермой отдельных хряков, обеспечивающей стабильные результаты.

В настоящее время разработан и испытан метод криоконсервации спермы хряков, предусматривающий ее концентрирование путем центрифугирования после выдержки в разбавленном состоянии.

Для замораживания используют сперму хряков пород крупная белая, ландрас, дюрок и помесных в возрасте от 1,5 до 5 лет. Режим использования животных — одна садка в неделю. Для криоконсервации используют эякуляты после их оценки по физиологическим и биохимическим показателям, а именно: с концентрацией не менее 150 млн/мл и активностью не ниже 8 баллов. Кроме того, для оценки криорезистентности спермы используют полярографический тест на стимуляцию дыхания янтаратом калия и 2,4-динитрофенелом (2,4-ДНФ), а также тест устойчивости к холодовому удару. Замороженно-оттаянную сперму оценивают по активности, времени переживания, времени редукции метиленовой сини (РМС), оплодотворяющей способности.

Подготовку спермы к замораживанию и ее замораживание проводят по ранее разработанной технологии — замораживание целого эякулята (контроль) и по новой технологии, предусматривающей концентрирование. Эта технология состоит в следующем. Сразу после получения сперму помещают в термостат (температура 34°С) и выдерживают в нем в течение 40—60 мин. После выдержки сперму разбавляют средой 1 в центрифужных стаканах вместимостью 150— 300 мл в отношении 1 : 1 и помещают в холодильную камеру, в которой поддерживается температура 14—16°С.

При разбавлении температура среды не должна отличаться от температуры спермы. В холодильной камере сперму выдерживают в течение 2 ч. При этом нельзя превышать скорость снижения температуры, так как это может вызвать явление холодового удара, что отрицательно влияет на жизнеспособность спермиев. Разбавление средой 1 и постепенное охлаждение спермы до температуры от -20 до -22°С способствует уменьшению активизирующего влияния плазмы на спермии, снижению в них уровня окислительных процессов, которые влияют на устойчивость спермиев при хранении (табл. 9.5).

Таблица 9.5

Состав сред для замораживания спермы хряков

(по А.М. Петрову)

Компоненты сред

Среда 1, г

Среда 2, г

Глюкоза

38,0

15,0

Сахароза

22,5

70,0

Цитрат натрия трехзамещенный 5,5 водный

2,78

2,78

Цитрат калия трехзамещенный

0,65

0,65

Этилендиаминтетрацетат (хелатон)

1,0

1,0

Мочевина

3,0

1,5

Унитол

0,20-0,25

0,25

Желток куриного яйца

100 мл

Вода

1000 мл

1000 мл

После выдержки охлажденную до указанной температуры сперму центрифугируют в течение 15 мин при 700 g (1500 об/мин с большой насадкой). Чтобы избежать вторичного повышения температуры при центрифугировании необходимо пользоваться рефрижераторной центрифугой или центрифугой с водяным охлаждением. Температура в камере центрифуги не должна превышать 16—18°С.

После центрифугирования надосадок (плазма + среда 1) удаляют так, чтобы концентрация спермиев и оставшейся части надосадка составляла 1,5 млрд клеток в 1 мл. Осадок спермиев ресуспендируют в среде 2 в отношении 1 : 1 и переливают во флаконы из темного стекла вместимостью 100 мл. Флаконы помещают в холодильную камеру, в которой поддерживается температура 14—16°С. Количество охлаждаемой спермы в одном флаконе должно быть не более 75 мл. Через полчаса эти флаконы переносят во вторую холодильную камеру, имеющую температуру 2—4°С. Время выдержки спермы при данной температуре — 1 ч. Средняя скорость снижения температуры — 0,2°С/мин.

После охлаждения до 5 ± ГС в сперму добавляют охлажденный 50%-й раствор глицерина, разведенного в среде 2 так, чтобы конечная концентрация глицерина составляла 2%. Флаконы со спермой помещают в ледяную ванну и выдерживают в ней в течение 25—30 мин.

Замораживают сперму (в результате она имеет вид гранул объемом 1 мл) на фторопластовой пластинке с лунками, охлажденной в парах азота до температуры от -85 до -95°С. После замерзания гранул их опускают в жидкий азот. Дозы спермы на осеменение (20—25 гранул) помещают в марлевые мешочки, маркируют и хранят в жидком азоте. Гранулы размораживают в приборе для оттаивания спермы при температуре 42°С. Оттаянную сперму разбавляют средой для оттаивания в отношении 1 : 4.

Таким образом, концентрирование улучшает все физиологические и биохимические показатели криоконсервированной спермы в сравнении с замороженным неконцентрированным эякулятом. Оплодотворяемость свиноматок концентрированной спермой составляет 64% против 48% при осеменении целой спермой, при этом снижается эмбриональная смертность.

Основное преимущество новой технологии состоит в том, что объем замораживаемой спермодозы уменьшается в 4—5 раз и более, чем при замораживании целого эякулята, и более чем в 2 раза, чем при замораживании густой фракции. Следовательно, данная технология является более эффективной и приемлемой для использования в производстве.

Правила техники безопасности при замораживании спермы. При

работе с жидким азотом необходимо соблюдать правила техники безопасности.

Жидкий азот — прозрачная, бесцветная, легкоиспаряющаяся жидкость массовой плотностью 0,804 кг/л при давлении 760 мм рт. ст. В обычных условиях он химически инертен. Производят его путем сжижения газообразного азота, полученного с воздухоразделительных установок. Попадая на открытые участки тела, он вызывает обморожение.

Работать с жидким азотом нужно всегда в защитных очках и кожаных рукавицах или перчатках. При попадании жидкого азота на открытый участок тела его необходимо обмыть водой, так как может произойти обморожение. Запрещается заглядывать в горловину сосуда Дьюара во время заливки его жидким азотом, так как при этом возможен выброс жидкости вследствие образования большого количества паров. Помещение, в котором хранят сосуды Дьюара с жидким азотом, оборудуют приточновытяжной или принудительной вентиляцией; избыток концентрации азота в помещении вызывает головную боль, головокружение, тошноту и даже потерю сознания. При появлении обморочного состояния пострадавшего выносят из помещения на свежий воздух. Во время эксплуатации сосуда Дьюара нельзя плотно закрывать его горловину, так как при испарении жидкого азота и прекращении выхода газа в атмосферу будет создаваться повышенное давление внутри сосуда, и он может взорваться.

При подготовке сосуда к перевозке авиатранспортом его заливают жидким азотом наполовину гидравлической емкости. В целях предотвращения образования взрывоопасной смеси в сосуде вследствие обогащения жидкого азота кислородом производят его контроль с помощью переносного газоанализатора ГХП-3. Такой анализ проводят в хранилище 1 раз в год, а в сосудах на пунктах — 1 раз в 6 мес. Если накопление кислорода составит 15%, сосуд Дьюара необходимо опорожнить в безопасном месте, свободном от предметов органического происхождения: дерева, бумаги, тряпок (особенно промасленных), навоза и др.

Повторение пройденного

  • 1. Научные основы получения спермы.
  • 2. Способы получения спермы от производителей и их значение.
  • 3. Наиболее распространенные методы оценки качества спермы.
  • 4. Внешние признаки, по которым сперму бракуют.
  • 5. Минимальные показатели свежеполученной спермы, пригодной для разбавления и осеменения коров, овец, свиней и кобыл.
  • 6. Значение синтетических сред и их отдельных компонентов.
  • 7. Санитарно-гигиенические требования к приготовлению сред и разбавлению спермы.
  • 8. Состав основных синтетических сред для спермы быка, барана, жеребца и хряка.
  • 9. Правила разбавления спермы. Степень разбавления. Количество спер-миев в дозе, активность и переживаемость их.
 
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ     След >