ОПЛОДОТВОРЕНИЕ И ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

СУЩНОСТЬ И ПРОЦЕСС ОПЛОДОТВОРЕНИЯ

Оплодотворение — слияние мужской половой клетки (спермия) с женской половой клеткой (яйцеклеткой, яйцом), имеющих гаплоидный набор хромосом, в результате чего образуется новая клетка — зигота с диплоидным набором хромосом, дающая начало развитию нового организма, обладающего двойной наследственностью (матери и отца).

Сущность оплодотворения была раскрыта к 1970-м гг., когда швейцарец Г. Фоль, немец Г. Гертвиг и ряд других исследователей описали процесс созревания яйцеклетки, проникновение в нее спермия, обосновали представление о сближении женского и мужского ядер, об их соединении в первое ядро дробления. В 1913 г. американский эмбриолог Ф.Р. Лилли выдвинул первую гипотезу о механизме соединения разнополых гамет. Он высказал предположение, что яйцеклетка вырабатывает и выделяет определенное вещество, названное им фертилизином (оплодотворяющим веществом), обеспечивающее соединение спермия с яйцеклеткой. И хотя в последующем эта гипотеза была отвергнута, она послужила отправным пунктом и стимулом для дальнейших исследований.

Исследования, проведенные в 1950—1960-х гг. в Японии (Дж. Дэн), Соединенных Штатах Америки (А.Л. и Л.Х. Колвин и др.), в нашей стране (А.С. Гинзбург), а также учеными в других странах, привели к открытию акросомной реакции у спермиев, имеющей первостепенное значение для их проникновения в яйцеклетку, и кортикальной реакции в яйцеклетке, защищающей ее от полиспермии. В последнее десятилетие работы американских ученых (П.М. Вас-сармана и др.) дали ответы на важнейшие вопросы о молекулярных основах оплодотворения у млекопитающих.

Основные биологические свойства, необходимые для осуществления оплодотворения, у половых клеток сформировались в процессе эволюции. Женские половые клетки приобрели способность накапливать запас питательных веществ, необходимый для начального этапа развития зародыша, и выработали надежный механизм, обеспечивающий прочное прикрепление к ним спермиев и нормальную генетическую структуру зиготы (соединение ядра яйцеклетки только с ядром одного спермия). У мужских половых клеток развились специальный двигательный аппарат (подвижный жгутик-хвостик) для приближения к яйцеклетке и приспособление (акро-сома) для проникновения и внесения в нее отцовского наследственного материала.

Оплодотворение у млекопитающих происходит в верхней трети яйцепроводов — в области ампулярно-истмусного соединения. Поэтому, прежде чем говорить о процессе оплодотворения, остановимся на вопросах транспортировки эякулированных спермиев в половых путях самки и на различного рода влияниях, которым они подвергаются в женском половом тракте.

При коитусе спермин в составе плазмы вводятся в краниальную часть влагалища, омывая шейку матки (у крупного и мелкого рогатого скота, кроликов, приматов), или проталкиваются через канал шейки непосредственно в матку (у свиньи, лошади, собаки, многих грызунов). В дальнейшем продвижение спермиев к месту оплодотворения осуществляется как за счет их собственной подвижности и способности продвигаться против тока жидкости (особенно в шейке матки и в области соединения матки с яйцепроводами), так и благодаря мышечным и антиперистальтическим сокращениям стенок полового тракта самки, создающим в нем отрицательное давление и эффект засасывания.

Стимуляция сократительных механизмов гладкой мускулатуры матки и яйцепроводов осуществляется при этом за счет простаглан-динов группы Е, присутствующих в сперме самцов, окситоцина, выбрасываемого из задней доли гипофиза во время полового акта (или искусственного осеменения).

У животных с маточным типом естественного осеменения уже к концу коитуса спермин заполняют маточные рога на всем их протяжении, а у коров и овец они достигают верхушки рогов через несколько минут. Область соединения матки с яйцепроводом является резервуаром для спермиев, откуда они постепенно перемещаются в яйцепровод.

У животных с влагалищным типом осеменения важнейшим депо спермиев в течение первых 24 ч являются также цервикальные и маточные железы. В ампулах яйцепроводов спермии быка в достаточном для оплодотворения количестве накапливаются через 6—8 ч после проникновения в канал шейки матки. Спермиям барана требуется более длительный промежуток времени — до 12 ч, хряка — около 2 ч, жеребца — 50—60 мин. В процессе продвижения спермиев по половым путям самки их большая часть теряется и погибает. Из нескольких миллиардов или миллионов спермиев, попавших в половой тракт во время коитуса или при искусственном осеменении, лишь несколько тысяч или только сотен достигают места оплодотворения — ампульной части яйцепровода.

Причины такой большой потери спермиев окончательно не раскрыты. Предполагается, что значительная часть половых клеток, образовавшихся во время сперматогенеза, является генетически атипичной и задерживается в области перешейка (ЫИтиза) яйцепро-вода. По некоторым исследованиям, число способных к оплодотворению спермиев у человека уменьшилось примерно с 70% в 1966 г. до 30% в 1986 г. (Р. Энберг, А. Яблоков).

Через перешеек в ампулу проникают только жизнеспособные спермии. Процесс отбора жизнеспособных генетичеки полноценных спермиев находится под контролем секрета слизистой оболочки яй-цепровода, который воздействует на плазматическую мембрану головки спермия и ее акросому. Жизнеспособными являются только половые клетки, у которых мембрана сохраняет стабильность. Этот отбор генетически неполноценных половых клеток, видимо, и должен быть компенсирован большим числом спермиев, вводимых в половые пути самки.

Ограниченное поступление спермиев через перешеек яйцепро-вода, вероятно, важно и для предупреждения патологической полиспермии, т.е. оплодотворения яйцеклетки многими спермиями.

Вместе с тем можно допустить, что и то число спермиев, которое проникает к месту оплодотворения, превышает необходимое количество, так как женская половая клетка сливается только с одной мужской половой клеткой, однако если сопоставить микроскопические размеры спермиев с объемом ампулы яйцепровода, то окажется, что их концентрация невелика. Тем более что движение спермиев вокруг яйцеклетки не упорядочено, а в контакт с ней они вступают в результате случайного столкновения.

Доказано, что биологически активные вещества, выделяемые в окружающую среду овулировавшим фолликулом и яйцеклеткой, не вызывают со стороны спермиев хемотаксиса (их направленного движения в сторону яйцеклетки). В то же время имеются данные, свидетельствующие о том, что эти вещества способствуют активизации движения спермиев, продлевают период их активного движения, повышая тем самым возможность установления контакта между мужской и женской половыми гаметами.

В период продвижения спермиев по половому тракту самки они подвергаются различным физическим и биохимическим воздействиям со стороны секрета матки и яйцепроводов, в результате чего в них совершаются значительные физиологические, морфологические и молекулярно-биологические изменения, приводящие к окончательному созреванию спермиев и приобретению ими оплодотворяющей способности.

В процессе этих изменений происходят удаление с поверхности спермиев слоя стабилизирующих гликопротеинов, приобретенного ими в придатке семенника и при смешивании с плазмой спермы во время эякуляции, изменение макромолекулярной структуры мембраны спермия, вследствие чего увеличивается его подвижность и способность выделять из акросомной области головки протеолитические ферменты, необходимые для растворения лучистого венца яйцеклетки.

Время, необходимое для завершения реакции капацитации, у разных видов животных различно. Так, для капацитации спермиев барана требуется 1 — 1,5 ч, хряка — 2—3 ч, быка и кролика — 5—6 ч, приматов — 4—5 ч после эякуляции.

Продолжительность жизни и сохранение оплодотворяющей способности спермиев, находящихся в яйцепроводах крупного и мелкого рогатого скота, свиньи, изчисляется 24—48 ч, а у лошади она может составлять до 6 сут. Тем не менее необходимо учитывать, что старение мужских половых клеток, отмечаемое в процессе их длительного пребывания в половом тракте самки (более 24 ч), может отрицательно сказаться на развитии и выживании зародыша, на общей плодовитости животных.

Зрелая яйцеклетка, окруженная прозрачной оболочкой и лучистым венцом, после овуляции попадает на бахромку и в воронку яйцепровода, откуда в результате его перистальтических сокращений и мерцательных движений ресничек эпителия быстро проходит в ампулярную часть и попадает в окружение сотен или тысяч находящихся здесь спермиев.

Процесс оплодотворения включает ряд этапов, совершающихся в определенной последовательности.

На первом подготовительном этапе спермии, окружившие яйцеклетку, с помощью выделяемых ими ферментов (гиалуронидазы, муциназы, трипсиноподобных и др.) деполимеризируют вещество, склеивающее клетки лучистого венца, разрыхляют его и вызывают частичное рассеивание фолликулярных клеток. После этого спермии входят в контакт с прозрачной оболочкой (zona pelucida), которая представляет собой сложную биологическую систему, образованную множеством компонентов гликопротеинов, имеющих молекулярную массу 200, 120 и 83 тыс. дальтон и обозначенных П.М. Вассарманом соответственно ZP1, ZP2 и ZP3. Последние низ них (ZP3) являются рецепторами мужских половых клеток, которые обеспечивают их прочное прикрепление к zone pelucida. При этом ZP3 реагирует только со спермиями, имеющими интактную акросому, на головке которой содержится множество белков, узнающих соответствующие рецепторы яйцеклетки. Каждый спермий может связывать до 10— 50 тыс. рецепторных молекул, что соответствует количеству реагирующих белков на головке спермия.

Если на этапе рассеивания клеток лучистого венца видовая избирательность отсутствует, то реакция связывания спермия с яйцеклеткой видоспецифична. Рецепторы ее прозрачной оболочки узнают и обеспечивают прикрепление спермиев самца того же вида. За редким исключением (при спаривании лошади и осла) зародыши, возникающие в результате межвидового оплодотворения, не могут развиваться нормально и погибают.

На следующем этапе происходит внедрение спермиев в прозрачную оболочку яйцеклетки и ее перивителлиновое пространство. У прикрепленных к прозрачной оболочке спермиев развивается так называемая акросомная реакция, индуктором которой является все тот же гликопротеин ZPZ. В ходе этой реакции передние ²/₃ плазматической мембраны головки спермия сливаются с передней частью мембраны акросомы. Слившиеся мембраны сначала образуют пузырьки, которые через некоторое время исчезают. Протеолитические и другие ферменты акросомы вступают в контакт с прозрачной оболочкой яйцеклетки, локально разрушая ее и создавая условия для продвижения спермия в глубь яйцеклетки.

Один из множества спермиев, продвигающихся к яйцеклетке и достигающих перивителлинового пространства, вступает в контакт с плазматической (желточной) мембраной яйцеклетки.

На этом этапе оплодотворения спермий сливается с плазматической мембраной яйцеклетки и проникает в ооплазму. Хвостик спермия разрушается, а головка, набухая и увеличиваясь в размерах, перемещается к центру яйцеклетки. Под влиянием ооплазмы оболочка ядра разрушается, его хроматин разрыхляется и после взаимодействия с белками ооплазмы ядро спермия превращается в мужской пронуклеус.

Соприкосновение спермия с желточной оболочкой яйцеклетки и следующее за этим слияние плазматических мембран обеих гамет ведет к очень быстрым специфическим преобразованиям в яйцеклетке. За несколько секунд в ходе так называемой кортикальной реакции резко изменяются молекулярно-биологические свойства плазматической мембраны, а за несколько минут в ходе реакции, называемой зонной, изменяются свойства и zona pelucida. Плазматическая мембрана и наружная прозрачная оболочка яйцеклетки становятся невосприимчивыми к другим мужским половым клеткам.

Эта реакция характеризуется слиянием кортикальных (желточных) гранул ооплазмы с плазматической мембраной и выходом их содержимого в zona pellucida. Она начинается на месте проникновения спермия в яйцеклетку и волнообразно распространяется во все стороны по ее поверхности. В ходе этой реакции ферменты кортикальных гранул, проникая в перивителлиновое пространство и в zona pellucida, модифицируют гликопротеин Z/*3, который теряет свою способность связываться со спермиями и вызывать у них акро-сомную реакцию. Это защищает яйцеклетку от полиспермии и гибели.

В процессе слияния яйцеклетки со спермием в ней резко активизируется обмен веществ и снимается блокада мейоза. Это ведет к завершению второго длительного созревания и отделению от ядра второго полярного тельца. Хромосомы оставшегося женского ядра деконденсируются и преобразуются в женский пронуклеус.

На заключительном этапе оплодотворения происходит слияние мужского и женского пронуклеусов и образование единого ядра новой клетки — зиготы с восстановлением диплоидного набора хромосом, объединением отцовского и материнского генетического материала и активизацией синтеза ядерной ДНК.

Неполноценные яйцеклетки, так же как и оставшиеся в половых путях спермии, подвергаются дегенерации, лизису и фагоцитозу.

Для нормального процесса оплодотворения, а следовательно, и формирования жизнеспособного эмбриона и плода, необходимо соединение только полноценных половых клеток. Неполноценные гаметы или не вступают в процесс оплодотворения, или из таких гамет после оплодотворения развиваются мало жизнеспособные зародыши, часто погибающие на ранней стадии развития. В связи с этим для поддержания высокой оплодотворяемости и плодовитости животных исключительно важное значение имеет высокое биологическое качество половых клеток. Оно определяется возрастом животных, состоянием здоровья и полноценностью метаболических процессов в их организме, а также возрастом гамет, вступающих в контакт.

В противоположность спермиям, сохраняющим свою оплодотворяющую способность в течение 24—48 ч, яйцеклетки сохраняют ее: у свиней — всего лишь в течение 8— 12 ч, а у коров и овец — 10— 15 ч после овуляции. Кроме того, следует иметь в виду, что нормальное развитие зародыша после оплодотворения и сохранение беременности наблюдаются, только если оплодотворение наступает в первые 4—6 ч после овуляции.

Оплодотворение во второй половине жизни яйцеклетки предрасполагает к нарушению развития и ранней гибели зародыша. Эти данные определяют исключительную важность правильного выбора срока осеменения животных. Оптимальным временем принято считать интервал в пределах 12—16 ч до овуляции.

В производственных условиях этим временем является феномен половой охоты, который устанавливается самцом. Этот период введения спермы в половые пути самки наиболее благоприятен как по отношению к овуляции, так в связи с максимальным развитием ан-типеристальтических сокращений матки, обильным выделением из открытого канала шейки эластичного гелеобразного секрета (слизи), имеющего низкую вязкость, обладающего высокой бактерицидно-стью и пропускающего только спермиев, обладающих свойством реотаксиса — способностью двигаться прямолинейно-поступательно против тока жидкости. Только в этот период создаются оптимальные условия для продвижения спермиев по половым путям самки к месту оплодотворения.

Поэтому своевременное и безошибочное выявление охоты у животных должно рассматриваться как одно из важнейших условий организации и проведения искусственного осеменения. Немаловажное значение в результативности осеменения имеет также функциональное состояние половых путей самки, в которых происходят дозревание спермиев и их селективный отбор.

Изучение процесса оплодотворения у млекопитающих на молекулярном уровне продолжается. Ведутся работы по идентификации гена, кодирующего гликопротеин ZP3, выделению ферментов кортикальных гранул яйцеклетки, катализирующих кортикальную и зонную реакции, и подругам направлениям.

Получение положительных результатов этих работ может привести к разработке новых методов и средств управления процессами размножения животных.