НОВЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ВОСПРОИЗВОДСТВА ЖИВОТНЫХ. ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЭМБРИОНОВ

Предполагается, что в странах с высокоразвитым молочным скотоводством 81% телят будут получать посредством трансплантации эмбрионов, остальных — методом искусственного осеменения, что облегчает реализацию генетических программ. При этом значительную роль призваны сыграть банки эмбрионов как средство сохранения генофонда. Есть основания полагать, что селекционные программы, основанные на применении трансплантации эмбрионов, приведут к созданию в короткие сроки элитных стад коров с уровнем продуктивности 12—15 тыс. кг молока в год. Следует знать, что трансплантация эмбрионов увеличивает шансы на генетическое улучшение стада, но не гарантирует его, так как здесь наслаивается влияние ряда эндо- и экзогенных факторов. Трансплантация эмбрионов оправдывает себя лишь в экономически развитых племенных хозяйствах с прочной кормовой базой, высокой культурой зооветеринарной работы, при уровне приживляемости эмбрионов не ниже 50%.

На данном этапе внедрения метода основной его целью является получение от выдающихся самок самцов-трансплантантов, от интенсивности использования которых через искусственное осеменение и будет зависеть эффективность мероприятий. Трансплантация эмбрионов позволяет увеличить количество двойных отелов за счет пересадки двух эмбрионов в оба рога или подсадки эмбриона в свободный рог матки ранее осемененных коров и телок.

С помощью метода трансплантации можно ускорить оценку коров и быков на носительство рецессивных генов. Осеменяют, например, спермой молодого проверяемого быка корову, вымывают у нее эмбрион и пересаживают его заведомо здоровому реципиенту, извлекают его на 60-е сут беременности и подвергают исследованию. Бейкер и другие ученые (1980) сообщают, что при такой проверке четыре из восьми сыновей одного быка с ослиным копытом оказались носителями этого генетического дефекта. Бык был исключен из числа производителей.

Метод трансплантации эмбрионов позволяет наиболее глубоко изучить роль матки в становлении функции желтого тела. Установлено, например, что эмбрион овцы должен присутсвовать в матке не позже 12-х сут, а эмбрион коровы — не позже 16-х сут после охоты (Ньюкомб, 1977). Было также установлено, что матка овец при одной-двух овуляциях обладает такой же способностью к плодоношению, как и при двух-четырех овуляциях (Бредфорд и др., 1977), тогда как свиньи не способны вынашивать больше плодов, чем произошло овуляций (Дзиук, Дэй, 1977). У крупного рогатого скота двойневость бывает выше при пересадке по одному эмбриону в каждый рог матки, чем при пересадке двух эмбрионов в один рог матки.

Дальнейший прогресс трансплантации эмбрионов зависит в основном от воздействия на него фундаментальных разработок в таких направлениях, как культивирование овоцитов и их оплодотворение вне организма, разделение зиготы на отдельные бластомеры, пересадка ядра соматической клетки животного-донора в яйцо, из которого таковое предварительно изъято, сплайсинг генов, межвидовая трансплантация эмбрионов, получение химерных животных, клонирование эмбрионов, определение пола эмбрионов, иммунобиология трансплантации эмбрионов.

Большим резервом повышения эффективности воспроизводства животных является увеличение выхода у них яйцеклеток. Путем гормональных обработок уровень суперовуляции можно довести до нескольких десятков, но в яичниках остаются еще сотни незрелых яйцеклеток (овоцитов). Следовательно, исполнительным источником эмбрионов может стать культивирование и оплодотворение вне организма овариальных овоцитов. Их выделяют из яичников коров, по той или иной причине выбывших из эксплуатации. От одного животного можно выделить несколько десятков овоцитов.

Овоциты получают из полостных фолликулов диаметром 8—10 мм путем аспирации и культивируют на эмбриологических стеклах в капле питательной среды под вазелиновым маслом при температуре 37—37,5°С в течение 28—52 ч. В качестве культуральной жидкости используют среду ТС-199 с добавлением 15% бычьей сыворотки крови и пирувата натрия. При культивировании этим способом сразу проходит дозревание и становятся пригодными для оплодотворения 46% овоцитов (Григорьева Т.Е., 1980). Доказана возможность индивидуального культивирования овариальных фолликулов (Ковалев П.Ф. идр., 1986). Изолированные от яичника фолликулы помещают в роллерную установку и культивируют в среде ТС-199 с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота и гонадотропина при температуре 37°С в определенной газовой

среде. При использовании этого способа стадии вторичного овоцита достигают 50—54% яиц.

Оплодотворение овоцитов вне организма упирается в проблему капатации спермиев (своеобразной иммунной селекции последних в период миграции к месту оплодотворения, при которой обволакивающие агенты нейтрализуют маточными секретами; при этом устраняются поврежденные и погибшие спермин, но сохраняются биологически полноценные). В настоящее время применяют очень громоздкий биологический метод: сперму вводят в половые пути коровы или крольчихи; через несколько часов животное убивают; находящиеся в верхушках рогов и яйцепроводов спермии извлекают и помещают в физраствор, а затем переносят в среду с культивируемым овоцитом. В стадии разработки химический метод кастрации спермиев (в присутствии экзогенных активаторов и веществ, растворяющих их мембраны).

К сожалению, еще не подобран оптимальный состав среды для культивирования овоцитов и зигот; видимо, не может быть единой среды на весь период культивирования, тем более если необходимо управление развитием яйца и зиготы.

Первый теленок от оплодотворения вне организма был получен в 1981 г. Высказывается заманчивая идея о стимулировании созревания фолликулов и овуляции у неполовозрелых животных с целью получения от них яйцеклеток и эмбрионов и последующей их пересадки, что позволит сократить интервал между поколениями и ускорит раннюю оценку по потомству.

Заманчивым направлением дальнейшего совершенствования метода трансплантации эмбрионов является их разделение на бластомеры. 6—7-суточная морула крупного рогатого скота состоит из 40—64 бластомеров, каждый из которых теоретически может дать теленка. Таким образом, с одного эмбриона можно скопировать (клонировать) идентичных (монозиготных) близнецов и повысить эффективность использования доноров. Наиболее простым способом деления эмбрионов на бластомеры является ферментивный способ с использованием раствора проназы. При этом полученные эмбрионы обрабатывают в определеной последовательности и культивируют в средах Хэнкса, Версена, ТС-199, растворе проназы и др. В итоге такой обработки и культивирования в течение 24—30 ч в 2—2,5 раза увеличивается количество бластомеров, и они легко распадаются. Доказана возможность химического разделения бластомеров без их извлечения из яйцепроводов. Особого внимания заслуживает микрохирургия эмбрионов. Современная микрохирургическая техника позволяет разделить морулу на две половины с последующей упаковкой каждой из них в прозрачную оболочку дегенерированного яйца; их культивируют 18—24 ч, после чего помещают в оба рога матки реципиента.

ззо

Большие надежды возлагают на сплайсинг генов — перенос генетической информации из генома одного организма в геном другого, изменение функции собственного гена за счет вставок чужого гена в него и около него и получение на этой основе трансгенных животных, несущих в себе экзогенный ген. Методами молекулярной, генной инженерии можно выделить из ДНК ген, определяющий желаемый признак у одного организма, и перенести его в другую ДНК. Возможности генной инженерии значительно увеличились после открытия в 1970-х гг. микробных ферментов, рестриктаз, позволяющих разрезать молекулы ДНК в четко определенном месте и выделять нужные участки ее молекулы, что позволило искусственно сливать гены, т.е. создавать рекомбинацию ДНК. Одна рестриктаза расщепляет ДНК в одном месте, другая — в ином и т.д. Основными видами физического переноса генов являются микроинъекции ДНК в пронуклеус зиготы и электропорация — перенос ДНК непосредственно через клеточную мембрану посредством электрического тока. В качестве химических методов переноса генов широко используется компенсирование ДНК с фосфатом кальция или диэтилами-ноэтилдекстраном, с которым она дает преципитаты.

Значительный интерес для биологов представляет опыт межвидовой трансплантации эмбрионов. Так, получены положительные результаты при выращивании эмбрионов коз в матке овцы; получены ослята при трансплантации бластоцист ослиц кобыле, а также жеребята при пересадке эмбриона кобыл ослице. Дарант и Берниршке (1984 г.) полагают, что отдельные виды домашних животных можно использовать в качестве реципиентов эмбрионов редких, вымирающих диких животных.

Внимание привлекает возможность получения химерных организмов, состоящих из генетически разнородных тканей и клеток. Химеры могут быть трех типов: сочетающие в себе разнокачественные ткани, разнокачественные группы клеток в пределах одной и той же ткани, различные органоиды внутри одной клетки с неравномерным распределением их при клеточном делении. В практике животноводства химеры можно получить путем соединения двух эмбрионов или их двух половинок разных (сразу четырех) родителей. Химеризм не имеет ничего общего с гибридизацией.

Определенный интерес в теоретическом плане представляют опыты по клонированию (вегетативному размножению) эмбрионов. Наметились следующие пути искусственного клонирования животных посредством исключения участия одного из родителей из оплодотворения:

• 1) партогенетический — развитие особи из яйцеклетки без участия спермий;
• 2) гипогенетический — развитие особи из зиготы, из которой удалено мужское ядро;
• 3) адрогенетический — развитие особи из зиготы, из которой удалено женское ядро;
• 4) получение животных из яйцеклеток, ядра которых заменены ядрами соматических клеток.

Научно-технический прогресс в области трансплантации эмбрионов позволяет в скором времени перейти к определению пола у пересаживаемых эмбрионов. В 1978 г. Д. Митчелл со своими сотрудниками первым произвел такие опыты на 14—18-суточных эмбрионах крупного рогатого скота: вырезали небольшие фрагменты трофо-бласты (0,5 мм²) и на основании хромосомного анализа определяли пол животного.

В настоящее время ведутся исследования по совершенствованию этого метода с применением иммунологических, цитологических и метаболических показателей. Иммунологический метод определения пола эмбриона базируется на идентификации антигенов, специфических показателей. Перспективна биопсия клеток морулы с их последующим культивированием. Точным и наименее безопасным является цитогенетический метод, позволяющий на стадии морулы в ядрах клеток будущих самок определить половой хроматин. Перспективен для крупного рогатого скота цитологический анализ хромосомного комплекса вырезанных из трофобласта эмбриона клеток.

В теоретическом и практическом плане несомненный интерес представляет изучение иммунобиологического аспекта трансплантации эмбрионов. Организм млекопитающих, как известно, обладает органической толерантностью к пересаженным тканям. Пересаживаемый эмбрион (и развивающийся из него плод) является носителем антигенов двух чуждых родителей и на 100% чужд реципиенту, что побуждает к развитию иммунных реакций (общих и местных) типа антиген — антитело. Развивающиеся в присутствии антигенов спермы или эмбриона реакции клеточного и гуморального иммунитета осуществляются путем взаимодействия трех категорий клеток белой крови: Т- и 5-лимфоцитов и макрофагов. В иммунологически компетентном организме самки относительно развивающихся в ее утробе изменений, связанных с беременностью, матка является привилегированным органом для выживания эмбриона. Его активность служит сигналом для материнского организма о необходимости защиты, имплантации. Если в локальном ответе более выраженными окажутся реакции иммунной толерантности, то беременность сохраняется, если же перевес будет на стороне реакции отторжения, то наступит аборт.

Очевидна необходимость полной расшифровки механизмов иммунологии трансплантации эмбрионов с целью направленного регулирования иммунологических процессов.

Повторение пройденного

• 1. Синхронизация половой охоты у доноров и реципиентов.
• 2. Доза спермы, которую надо вводить донорам после обработки для вызывания суперовуляции.
• 3. Соотношение ФСГ и Л Г в гонадотропинах, которое оказывает наиболее благотворное влияние на реакцию яичников.
• 4. Признаки, отличающие эмбрион от яйцеклетки.
• 5. Отличия морулы от бластоцисты.
• 6. Основа оценки качества эмбрионов.
• 7. Инструменты, используемые при пересадке эмбрионов.
• 8. Определение правильности введения катетера в рог матки.
• 9. Методы пересадки эмбрионов (хирургический и нехирургический).