ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ФОСФОЛИПАЗЫ А2 В КЛИНИЧЕСКОЙ БИОХИМИИ

Американская ассоциация кардиологов и Центр по контролю заболеваний США рекомендуют оценивать прогностическое значение количественного определения ФЛ-2 на период до 10 лет при проведении долговременной первичной и вторичной профилактики заболеваний сердечно-сосудистой системы. Одновременно определение содержания фермента не рекомендовано использовать для оценки кратковременной терапии. Измерение содержания ФЛ-2 в плазме крови предложено как тест для определения наличия в коронарных артериях и сосудах мозга мягких, нестабильных бляшек, которые склонны к разрыву и формированию клинической картины атеротромбоза и ишемического инсульта. Измерение концентрации секреторной ФЛ-2 может быть использовано наравне с иными прогностическими тестами, если проводить количественное определение совместно с измерением содержания СРБ в субклиническом интервале при использовании высокочувствительного метода его определения. Физиологичный уровень СРБ при его высокочувствительном определении — до 0,3 мг/л в норме и около 10 мг/л при патологии. Существенным является вопрос о том, какой субстрат выбрать для гидролиза ФЛ-2 и какие продукты реакции при этом определять, осознавая, что ФЛ-2 задействована в разных биохимических превращениях ФЛ (рис. 8.1), перечисленных ниже.

  • 1. В составе апоА-I ЛПВП ФЛ-2 участвует в переносе к клеткам экзогенных ПНЖК в форме полярных ФЛ.
  • 2. В апоВ-100 ЛПОНП фосфолипаза участвует в направленном переносе к клеткам РСТ МЖК + НЖК + ННЖК — субстратов для выработки клетками энергии.
  • 3. В составе ЛПНП, которые не сформировали апоВ-100 лиганд, ФЛ-2 как компонент эндогенных флогогенов, безлигандных ЛП, клетки эндотелия путем биологической реакции трансцитоза переносят из внутрисосудистой среды в пул сбора и утилизации эндогенных флогогенов и экзогенных патогенов большой молекулярной массы в интиму артерий эластического типа, в которой раположены кластеры оседлых макрофагов.
  • 4. Одновременно ФЛ-2 задействована в синтезе в ЛП липофильных гуморальных медиаторов функциональной активности клеток, в частности ФАТ.

Окончательно не решено, в каком классе ЛП локализовано и проявляет активность основное количество ФЛ-2. В приведенных выше ситуациях ФЛ-2 как один (несколько сходных ферментов) гидролизует разные субстраты — разные ФЛ. Не ясно, освобождает ли ФЛ-2 ННЖК из бп-2 спирта глицерна в нативных ФЛ или только после того, как они будут окислены активными формами 02; возможно, ФЛ-2 действует в комплексах окисленные ЛПНП + аутоантитела.

простациклины...

Рис. 8.1. Фосфолипаза-А2: формирование НЭЖК при действии липоксигеназы, циклооксигеназы и синтез из ПНЖК лейкотриенов, простациклинов, тромбок-

санов. Образование гидроперекисей ФЛ

В клинике оценивают активность той ФЛ-2, которую клетки поджелудочной железы секретировали в панкреатический проток и которая истекает в 12-перстную кишку с целью гидролиза экзогенных ФЛ пищи. Далее идентифицирована иная ФЛ-2, которую сохраняют в гранулах цитоплазмы клетки РСТ, в частности тромбоциты, содержание и активность которой локально возрастает в очагах эндогенно инициированной биологической реакции воспаления. Эта ФЛ-2 функционально имеет много общего с ферментами яда змей и пчел. В настоящее время известно более 10 типов секреторных ФЛ, не говоря о тех ФЛ-2, которые содержит цитоплазма клеток и которые, не являясь секреторными, проявляют активность в составе внутриклеточных и плазматических мембран.

Все секреторные ФЛ-2 имеют молекулярную массу порядка 14—17 кДа, в каталитическом центре содержат остаток гистидина и проявляют активность в присутствии мМ концентраций Са++. Они имеют консервативные кластеры аминокислотных остатков, домены как в активном центре фермента, так и в месте связывания ионов Са++, 6—8 окисленных сульфгидрильных групп. К активному центру относят и аминокислотный остаток аспартата, который задействован в связывании Са++. ФЛ-2 не активна ни по отношению к эфирным связям глицерина с остатком ортофосфорной кислоты, ни по отношению к ЖК, которая этерифицирована в зп-1 глицерина (рис. 8.2). В составе ФЛ окисленные цепи ЖК являются более предпочтительным субстратом для ФЛ-2, по сравнению с нативными молекулами. Это определяет функциональные взаимоотношения между активностью секреторной ФЛ-2 и окислением ЖК активными формами 02. Окисление белков АФК является неотъемлемой частью биологической реакции воспаления — синдрома системного воспалительного ответа.

Фосфолипаза А,

О

У

О сн2 я, - с - о - сн

А

сн2

Фосфолипаза А2

- о - с - Я,

Фосфолипаза О О

У

- о - р- о -х

> к

он

Фосфолипаза С

Рис. 8.2. Структура фосфатидилхолина и место специфичного действия фос-фолипазы-А2 — гидролиз остатка ЖК из эп-2 трехатомного спирта глицерина

Чаще всего в клинической биохимии определяют количество секреторной, Са++ независимой ФЛ-2, которая гидролизует ЖК в бп-2 в ФЛ плазмы крови, проявляя активность в составе ЛПНП и ЛПВП. На основании этого фермент именуют ЛП ФЛ-2. В качестве субстрата для определения активности липазы используют ФАТ, в котором в 5П-2 этерифицирован ацетат. Фермент именуют

ФАТ-ацетилгидролаза. Это полипептид с молекулярной массой 45 кДа, состоит он из 441 аминокислотного остатка, имет 6 окисленных дисульфидных связей и обладает высокой специфичностью в отношении sn-2 в составе ФЛ. ЛП ФЛ-2 активно гидролизует со-6 и со-9 ННЖК в sn-2 в составе ФХ. Скорость гидролиза возрастает, если остаток ЖК в sn-2 содержит альдегидную или гидроксильную группу.

Спонтанные мутации с отсутствием синтеза Л П ФЛ-2 отмечены в популяции с частотой 4%. Это сопровождается врожденной недостаточностью фермента и выраженной биологической реакцией воспаления при разных патологических процессах. Экзогенное введение ФАТ приводит к быстрому повышению его содержания в крови и столь же быстрому снижению, в то время как все количество введенного ФАТ при дефиците ЛП ФЛ остается негидролизованным. Именно ЛП ФЛ-2 регулирует количество ФАТ в плазме крови — фактор, который активирует взаимодействие и ассоциацию всех клеток РСТ, хотя в его названии упомянуты только тромбоциты. У приматов и человека ЛП ФЛ-2 проявляет активность в составе ЛПНП, в то время как у грызунов — только в ЛПВП. В противоположность ФЛ-2, ЛП ФЛ не требует присутствия Са++, фермент подвержен сиалированию N-ацетилнейраминовой кислотой, а его активность ингибируют блокаторы сериновых протеаз. Макрофаги начинают активно синтезировать ФЛ-2 сразу после того, как в тканях заканчивается кратковременное превращение их из моноцитов гемматогенного происхождения в локальные макрофаги.

Эту способность макрофагов-рекрутов можно использовать в качестве диагностического теста активации биологической реакции воспаления, синдрома системного воспалительного ответа и активности биологической реакции врожденного иммунитета. Низкие количества мРНК для ЛП ФЛ-2 в циркулирующих моноцитах начинают увеличиваться по мере созревания в разных тканях молодых макрофагов. Превращение моноцитов в макрофаги в пуле межклеточной среды способен активировать, в частности, экзогенный инфекционный патоген — липополисахарид грамотрица-тельных бактерий.

Содержание белка ЛП ФЛ-2 в плазме крови позитивно и достоверно коррелирует с концентрацией первичных (провоспали-тельные и противовоспалительные интерлейкины, фактор некроза опухоли-а) и вторичных (белки острой фазы) гуморальных медиаторов синдрома системного воспалительного ответа. Высокая активность ЛП ФЛ-2 в сыворотке крови отмечена при разных по этиологии заболеваниях. Активно секретируют ФЛ-2 клетки РСТ, которые реализуют in vivo биологическую реакцию воспаления и биологическую реакцию врожденного иммунитета, реакцию защиты хозяина. ФЛ-2 присутствует в эндоплазматическом ретикулуме оседлых макрофагов, тучных клеток, тромбоцитов, фибробластов, а также в клетках интерстициальной ткани печени, селезенки, тимуса, костного мозга и кишечника.

Секрецию фермента локально на уровне ПС клеток (структурных и функциональных единиц органов) активируют первичные, гуморальные медиаторы биологической реакции воспаления (провоспа-лительные интерлейкины и интерферон-G), липополисахариды, форболовые эфиры и ростовые факторы. В некоторых клетках экспрессия секреторной ФЛ-2 в ЛП зависит от предварительной активации ФЛ-2 в цитоплазме и, возможно, активности синтеза эйкозаноидов. Глюкокортикоиды и противовоспалительные нестероидные препараты функционально являются участниками синдрома компенсаторной противовоспалительной защиты, они ингибируют секрецию клетками секреторной ФЛ-2. После выхода из цитоплазмы клеток РСТ в межклеточную среду ФЛ-2 связывается с апоВ-100 ЛП и становится ЛП ФЛ-2.

Экспрессия секреторной ФЛ-2 в клетках РСТ связана с гидролизом (освобождением) эссенциальной ПНЖК — со-6 С20:4 Арахи или со-3 С20:5 Эйкоза из аминофосфолипидов, в составе которых они депонированы в клетках, и последующим синтезом прово-спалительных простагландинов. При стимуляции эндотелия in vitro интерлейкином-1 происходит активация синтеза и секреции ФЛ-2 при одновременном усилении образования простагландина Е2. При добавлении в среду к секреторной ФЛ-2 антител, синтез простагландина Е2 становится меньше. При этом секреторная ФЛ-2 в инкубационной среде не оказывает влияния на активность ФЛ-2 плазматической мембраны.

Многочисленные белки плазматической мембраны способны связывать ФЛ-2 из межклеточной среды, однако параметрами рецептора обладает только один протеин. Белок имеет молекулярную массу порядка 180—200 кДа. Значительна часть его расположена вне клеток, а в цитоплазме находится только домен из 40 аминокислотных остатков. Белок без цитоплазматического домена пребывает в межклеточной среде в растворенном состоянии и может блокировать связывание клетками ФЛ-2 из внеклеточного пространства. ФЛ-2 и продукты метаболизма арахидоновой ЖК имеют существенную роль в активации реакции «респираторного взрыва» в нейтрофилах и продукции ими АФК в стадии: 1) прайминга (подготовки) нейтрофилов; 2) активации; 3) состояния гиперактивности столь недолго функционирующих нейтрофилов.

При реализации ферментативной активности секреторной ФЛ-2 в плазме крови увеличивается количество липофильных гуморальных регуляторов, а также связывание фермента со специфичными белками на плазматической мембране. Это взаимодействие влияет на митоген-активированные протеинкиназы, пути проведения сигналов в клетки, которые инициируют функциональные ответы в форме синтеза биологически активных гуморальных медиаторов, способности клеток к миграции и пролиферации. Кроме локальной, неспецифичной реакции воспаления на уровне ПС клеток, ЛП ФЛ-2 задействована в патогенезе синдрома ишемии тканей, новообразований, атеросклероза, ожирения. При этом действие ЛП ФЛ-2 в ЛПНП оценивают как проатерогенное действие.

ФЛ-2 участвует в синдроме острых респираторных нарушений у морских свинок и кроликов. После инъекций ФЛ-2 в ткани легких выявлено достоверное увеличение НЭЖК и лизофосфати-дилхолина. Содержание их уменьшается при применении ингибиторов сериновых протеаз параллельно уменьшению секреции ФЛ-2 в астроцитах и нейтрофилах. Возможно, наличие ФЛ-2 в кристаллической форме и знание ее третичной структуры будут условиями создания препаратов, которые будут специфично ингибировать активность секреторной ЛП ФЛ-2, если это будет клинически более эффективно, чем это осуществляют ингибиторы сериновых протеаз.

 
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ     След >