ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ГЕТЕРОГЕННОСТЬ СРВ

В клинической биохимии для определения СРВ в плазме крови применяют два метода, основанные на оптическом принципе им-мунотурбидиметрии, — клинический и субклинический, высокочувствительный. Это дало нам основание дифференцировать два диагностических интервала измерения СРВ: первый — субклинический (0,3—10 мг/л) и второй — клинический (10—1000 мг/л). Мы также предложили считать, что в субклиническом интервале СРВ как вторичный медиатор биологической реакции воспаления отражает острую фазу синдрома системного воспалительного ответа, который вызван «замусориванием» межклеточной среды эндогенными флогогенами, инициаторами биологической реакции воспаления. Это происходит при всех наиболее распространенных в популяции человека заболеваниях.

Повышение содержания СРВ в клиническом интервале вызвано также «замусориванием» межклеточной среды, но уже экзогенными, инфекционными патогенами. Мы полагаем, что необходимость двух методов определения СРВ, казалось бы, одних и тех же иммунных комплексов СРВ + антитело, продиктовано физико-химическими различиями самого антигена — СРВ. Он может иметь форму мономера и образовывать полимерные формы. Мы также полагаем, что в мономерной и пентамерной форме СРВ проявляет разную функциональную активность. Кроме того, рационально полагать, что повышение концентрации СРВ в плазме крови в 100 раз не может быть только регуляторным; при такой степени повышения белок «должен» исполнять определенную «рабочую» функцию.

СРБ-пентамер — гидрофильный протеин. Одновременно он способен к связыванию на гидрофобной поверхности плазматической мембраны и в монослое ФХ на поверхности, прежде всего ЛПОНП и в меньшей мере ЛПНП. Связывание СРБ-мономера и СРБ-пентамера с монослоем ФХ происходит при использовании разных доменов белка, структурных компонентов ФХ и лизоФХ аминокислотных остатков апоВ-100. Проведенные нами исследования показали, что в растворе очищенного белка при физиологичных значениях pH, как вероятно и в плазме крови, СРВ представляет дисперсную систему.

Доказать это можно, если корректно измерить радиус СРБ-мо-номера и его ассоциатов при анализе спектров рассеяния света. Подобные измерения мы провели на лазерном корреляционном спектрометре (Институт ядерной физики РАН, Санкт-Петербург).

  • 18
  • 6

О

  • 18
  • 6

О

  • 18
  • 6

О

  • 18
  • 6

О

  • 18
  • 6

О

  • 18
  • 6

О

  • 18
  • 6

О

pH 7,2

і І і і і і 111 І І і і і і м і І І і і і і 111 І І і і і і 111 І І і і і і 111 I

pH 6,5

  • 1 І і мімі І І і ііі ГП І І і і і 1111 І І і і і 1111 І І і і і м 11 I

pH 6,0

і—і і і 111 и-1—і мит і—і п

|— ГГГГГГІ-1 |—ГТ

pH 5,5

??

I-1 II I I I II-1-1 I I I I I И I-1 I ГГПТ1-1-1 I I I I III-1-1 п

pH 5,0

1—І І І 111II-1—І І І 111II I—І І І 111

I 1 і І І І І I

? ?? ?

р—і—і і 111 м |

pH 4,5

Т-ггт

I-гнпгЛ^-1-ГНГТТТТТ|-1-ГТТТТТТ]-1

pH 4,0

ттт

ТП1—

1000

І І 11III-1

10 000

Рис. 8.4. Распределение изоформ (пентамер — мономер) СРВ по величине гидродинамического радиуса Л/(/?ь) в растворе при разных значениях pH (ось ординат — гидродинамический радиус молекул СВР, отн. ед.; ось абсцисс —

радиус молекул СРВ, нм)

Наше предположение о полидисперстности СРБ в растворе подтверждает следующее:

  • 1) СРБ — олигомерный белок, субъединицы которого с молекулярной массой 25 кДа способны ассоциироваться и диссоциировать в зависимости от условий микроокружения, взаимодействия с гидрофобными лигандами и pH среды in vitro (рис. 8.4);
  • 2) нативный СРБ-пентамер способен в растворе к димеризации, спонтанной и активированной агрегации с формированием димерных, три-, тетра- и пентамерных структур с молекулярной массой до 125 кДа. При pH 6,8 СРБ реально составляет поли-дисперстную систему.

Данные лазерной корреляционной спектроскопии указывают на существенное отличие формы СРБ-пентамера от сферической. СРБ-пенамер — это сплющенный эллипсоид, состоящий из пяти мономеров. Отношение диаметра к толщине диска составляет 5:1. Субъединичная структура белка стабилизирована нековалентными взаимодействиями. Полученные результаты подтверждают: 1) наличие в биологических средах двух форм СРБ — мономера и пентамера и 2) всегда преобладающую форму СРБ-пентамера в плазме крови при биологической реакции воспаления.

На рис. 8.5 приведена функция распределения интенсивности рассеянного молекулами лазерного луча в относительных единицах в растворе СРБ концентрацией 26,7 мкм. При физиологичных значениях pH основная масса СРБ находится в растворе в форме пентамера. Однако при увеличении концентрации Н+ происходит диссоциация пентамеров и появление иных форм СРБ, вплоть до мономеров. При этом СРБ оказывается одновременно в нескольких формах с разными радиусами молекул в пентамерной и мономерной формах.

СРБ-мономер откладывается в атероматозных бляшках коронарных и сонных артерий, но не в нормальных артериях. СРБ-пентамер не найден в ткани ни здоровых, ни патологически измененных сосудов. Естественно, что формирование СРБ-мономера может быть результатом диссоциации СРБ-пентамера. Показано, что активированные тромбоциты, которые играют важную роль в формировании атеротромбоза, способны вызвать такую диссоциацию при действии лизофосфатидилхолина. Более того, диссоциация СРБ-пентамера на мономеры может быть инициирована и продуктами апоптоза.

Именно СРБ-мономер индуцирует большинство физиологичных действий: хемотаксис моноцитов, изменения конформации интегринов, формирование активных форм 02 и адгезию моноцитов

Е( со)

100 1000 10 000 мГц

Рис. 8.5. Интенсивность рассеянного света /(ш), отклонение экспериментальной функции от теоретической ?(ш) и интенсивность рассеянного света

/4(Г) по диффузному уширению для СРБ (pH 6,8)

на поверхности эндотелия. Пентраксины, к которым принадлежит и СРБ, являются белками, которые сформированы на ранних ступенях филогенеза и функционально хорошо отработаны. Несмотря на это, имеются разноречивые данные о механизмах реализации иммуномодулирующего, провоспалительного действия СРБ: СРБ-пентамера, СРБ-мономера и биотинилированного мономера. Однако нет простого метода, который бы установил это различие.

В условиях электрофореза взаимодействие с биотином меняет электрофоретическую подвижность СРБ; кроме того, СРБ-пен-тамер при действии додецилсульфата (БОБ-№) натрия может диссоциировать с образованием мономеров. При этом только СРБ-мономер проявляет чувствительность к трипсину и сериновым протеиназам нейтрофилов. Это указывает на то, что при формировании СРБ-пентамера конформация мономера меняется, формируя, по сути, более гидрофобную молекулу с образованием специфичной «четвертичной» структуры. Только биотинированные СРБ-пентамер и СРБ-мономер (но не нативный СРБ) связываются с клетками. Это указывает, что химическая модификация биотином и денатурация изменяют функциональные свойства СРБ. Ни СРБ-пентамер, ни СРБ-мономер не способны индуцировать секрецию хемокинов и внутриклеточных молекул адгезии в эндотелии.

СРБ проявляет активность по меньшей мере в двух формах — пентамера и мономера; различаются они антигенными свойствами, электрофоретической подвижностью и связыванием с лигандами. СРБ-пентамер активно связывается с монослем ФХ, антителами к пентамеру, но не к СРБ-мономеру. Растворимость СРБ-мономера в гидрофильной среде меньше, чем пентамера, поэтому мономер склонен к агрегации. Это дает основание говорить о функции in vivo двух форм СРБ, которые способны проявлять разные регуляторные и физиологичные свойства.

Наработка панели моноклональных к СРБ антител четко подтверждает различие иммуногенности и конформации молекулы СРБ, а также формирование функционально специфичных ассо-циатов. Первая группа антител реагирует только с нативным СРБ-пентамером, выявляя эпитопы, которые обеспечивают связывание с монослоем ФХ и лизофосфатидилхолином. Вторая группа включает антитела, которые реагируют с СРБ-пентамером, модифицированным при связывании с ФХ, поверхностью полистерола при отсутствии ионов Са, добавлении мочевины, SDS-Na, она является результатом действия в СРБ-пентамере пяти эпитопов. Связывание при участии нескольких эпитопов является более активным. Третья группа антител реагирует с СРБ-мономером при участии N-концевого домена (аминокислотные остатки 1 — 146). Четвертая группа антител реагирует только с СРБ-мономером, с его малым эпитопом у С-конца молекулы (остатки 147—206). В связывании СРБ-пентемера задействованы пять эпитопов его поверхности, а три иных эпитопа обеспечивают связывание СРБ-мономера. Действие только СРБ-мономера, но не пентамера, активирует клетки эндотелия. СРБ непосредственно действует на клетки, активируя продукцию цитокинов, экспрессию на плазматической мембране функционально разных молекул при взаимодействии с клетками.

Однако усиление синтеза интерлейкинов при действии СРБ с нативной конформацией пентамера в межклеточной среде на-

ступает только через 12—24 ч инкубации, в то время как выставление молекул адгезии на мембрану занимает всего 6 ч после воздействия липополисахаридов. Реально полагать, что в ассоциации с клетками-мишенями СРБ-пентамер претерпевает структурную перестройку, формируется конформация, при которой проявляется действие СРБ-мономера как иммуномодулятора. При этом на поверхности СРБ-мономера появляются новые эпитопы, которых не было у СРБ-пентамера, и происходит деструкция тех эпитопов, которые обеспечивают связывание пентамера.

Мало что известно о наличии на плазматической мембране клеток РСТ специфичных мест связывания — рецепторов для СРБ-пентамера и СРБ-мономера. Иммуногистохимическое определение локализации СРБ-мономера выявило его наличие в ткани артерии человека и в физиологичных условиях. Это подтвердило функциональную роль мономера в тканях, роль СРБ-пентамера в межклеточной среде и различие их функционального значения. На мембране лимфоцитов в периферической крови пациентов контрольной группы практически здоровых людей выявлено наличие СРБ-мономера.

Более вероятно, что именно СРБ-мономер как ранний в филогенезе гуморальный медиатор регулирует активность тромбоцитов, полиморфноядерных лейкоцитов и моноцитов. В условиях биологической реакции воспаления, но не в физиологичных условиях, СРБ-мономер можно выявить в тканях печени и скелетных мышц. Выявление мРНК для СРБ в интиме артерий эластического типа может быть свидетельством того, что:

  • 1) основная масса СРБ все-таки перенесена в интиму монослоем эндотелия путем биологической реакции транспитоза и поглощена макрофагами в форме безлигандных, окисленных (физиологично денатурированных) ЛПНП в виде эндогенных флогогенов;
  • 2) СРБ может быть синтезирован оседлыми (резидентными) макрофагами in situ. У разных видов животных в интиме артерий и свежих атеромах показано совместное расположение СРБ-пентамера, апоВ-100 и ТГ; это подтверждает поступление в интиму СРБ в составе апоВ-100 ЛП, вероятно, вместе с ЛПОНП и ЛПНП. При этом «атерогенные» способности СРБ-мономера незначительны. Это дает основание по-иному взглянуть на роль СРБ в формировании мягких бляшек, атероматоза и атеротромбоза интимы, образовании липидных пятен в интиме артерий. Роль СРБ-пентамера в формировании атероматоза является доминирующей по сравнению с СРБ-мономером. В то же время при аутоиммунной патологии аутоантитела формируются как к СРБ-моно-меру, так и к СРБ-пентамеру.

Нет сомнений в том, что действие СРБ и всего семейства пен-траксинов является отработанной в филогенезе системой, которая одинаково специфично осуществляет комплекс физиологичных и патофизиологичных функций у крабов рода Limulus, в тканях трески и in vivo у человека. Функция СРБ — это часть врожденной системы защиты хозяина. Основную массу СРБ из плазмы крови выводят в интиму клетки монослоя эндотелия при реализации биологической функции трансцитоза. Это является физиологичным процессом, при котором небольшие количества СРБ в составе апоВ-100 ЛП путем трансцитоза (макропиноцитоза) оказываются в плазме крови. При этом СРБ может быть связан как с монослоем ФХ на поверхности ЛПОНП, так и в составе ЛПНП.

Когда кровь на биохимические тесты берут у человека и животных натощак, после определенного периода отсутствия приема пищи в них нет (или мало) ЛПОНП; естественно, что СРБ находят в составе ЛПНП. Когда в плазме крови присутствуют ЛПОНП, основная масса СРБ связана с ними и в условиях большей аффинности, чем с ЛПНП. Это определено тем, что:

  • 1) гепатоциты синтезируют олеиновые, пальмитиновые, лино-левые и линоленовые ЛПОНП, а образованные в крови линолевые и линоленовые ЛПНП являются производными от одноименных ЛПОНП;
  • 2) площадь, занятая монослоем ФХ на поверхности ЛПОНП, во много раз больше, чем в структуре ЛПНП;
  • 3) интима не имеет vasa vasorum и ЖК для обеспечения функции оседлых макрофагов доставляют как ЛПОНП, так и ЛПНП путем пассивной диффузии.

Напомним, что функция ЛПОНП и ЛПНП в переносе ЖК является разной: ЛПОНП доставляют к оседлым макрофагам НЖК + + МЖК + ННЖК, которые клетки используют прежде всего как субстрат для наработки энергии, синтеза АТФ. ЛПНП, в свою очередь, доставляют к клеткам (эндотелий, фибробласты, лимфоциты) эссенциальные ПНЖК, которые необходимы для функции интегральных белков плазматической мембраны, синтеза эйко-заноидов и рекализации биологической реакции пролиферации. Показано, что СРБ при наличии в плазме крови ЛПОНП с разной аффинностью связывается с ЛПОНП и ЛПНП и что в патофизиологичных условиях ЛПОНП с ассоциированным СРБ являются предшественниками физиологичных и афизиологичных ЛПНП + СРБ. При аффинной хроматографии на колонке с сефадексом фракция выделенных СРБ всегда содержит апоВ-100, в то время как синтезированные гепатоцитами ЛПОНП не связывают СРБ; необходимо предварительное воздействие ЛП ФЛ-2 на монослой полярных липидов и образование лизофосфатидилхолина.

Если СРБ в силу: 1) физико-химического сродства и 2) функциональной роли в биохимической реакции врожденного иммунитета призван опсонизировать фрагменты клеток и тельца апоптоза, которые имеют поверхность, образованную ФХ и лизоФХ, он может связываться с ЛПОПН и ЛПНП, которые имеют подобные участки. В физиологично денатурированных путем сиалирования, гликирования, нитрозилирования, перекисного окисления ЛПНП, в которых окислению подвергается остаток ЖК в ьп-2 ФЛ с образованием лизоФХ, связывание СРБ происходит с предварительно измененными ЛПНП.

Рецепторами на плазматической мембране оседлых макрофагов, по данным проточной цитофлуорометрии и иммунофлу-оресцентной микроскопии, для комплексов ЛПНП + СРБ являются рецепторы-«мусорщики», но не рецепторы для связывания СРБ, которыми, более вероятно, являются СОЭ2. Связывание СРБ с ЛПНП есть Са++-зависимый процесс; каждая субъединица СРБ-пентамера использует два иона Са. При усилении фагоцитоза макрофагами комплекса ЛПНП + СРБ экспрессии РНК для С032 не происходит. Одновременно показана возможность взаимодействия СРБ не с «новорожденными», но нативными, не денатурированными ЛПОНП.

Денатурации ЛПОНП в крови практически не происходит, поскольку после секреции гепатоцитами их быстро поглощают клетки путем апоЕ/В-100 эндоцитоза. Часть из них превращается в ЛПНП, которые при образовании лиганда поглощают клетки путем апоВ-100 эндоцитоза. И только ЛПНП, которые не сформировали лиганд и поэтому длительно циркулируют в крови, становятся в межклеточной среде эндогенными флогогенами, после чего они подвергаются физиологичной денатурации, осуществляют которую в основном циркулирующие нейтрофилы путем образования и секреции АФК.

Полагают, что СРБ может связываться и с нативными ЛПОНП, после того как с ними ассоциируется ЛП ФЛ-2. Фермент гидролизует ФХ полярного монослоя с образованием лизоФХ, который выраженно увеличивает аффинность связывания СРБ с ЛПОНП. Эти комплексы нативных ЛПОНП после воздействия ЛП ФЛ, связывания СРБ, можно полагать, и поглощают макрофаги путем С032-эндоцитоза. Это подтверждают иммунофлуроморфологиче-ские наблюдения о совместной локализации в интиме апоВ-100, СРВ и CD32. Одновременно у мышей с выбитым геном апоЕ выбивание второго гена CD36 транслоказы ЖК уменьшает накопление липидов в интиме и макрофагах аорты. Вероятно, CD36 также может иметь отношение к формированию атероматоза.

В модельных экспериментах СРВ в форме пентамера и мономера способен связываться со всеми ЛПОНП и ЛПНП, причем как нативными, так и физиологично денатурированными in vivo. При этом для поглощения ЛП макрофаги используют функционально разные рецепторы. Более вероятно, что процессы поглощения клетками ЛПОНП и ЛПНП функционируют физиологично, постоянно, а иные формируются только в патофизиологичных условиях биологической реакции воспаления и не только в острый период, а на всем протяжении биологической функции эндоэкологии. Клетки синтезируют СРВ в форме планарного (плоского) пентамера. В рамках локального воспаления СРВ синтезируют клетки интерстициальной ткани in situ, а при формировании in vivo системной биологической реакции воспаления к синтезу СРБ-пентамера подключаются клетки печени.

Только в условиях биологической реакции воспаления в межклеточной среде появляются СРБ-мономеры. Они не могут ассоциироваться с образованием СРБ-пентамеров, но могут образовывать агрегаты. СРБ-мономеры не оказывают влияния на функциональную активность нейтрофилов. Одновременно СРБ-мономер ингибирует хемотаксис и инфильтрацию нейтрофилами очагов асептичного воспаления. Связывание СРБ-мономера с нейтрофилами можно блокировать антителами к CD 16 и CD 14. В этом действии принимают участие и толл-рецепторы, сенсоры сортировки молекул белка по принципу «свой — не свой», в то время как на взаимодействие с СРБ-пентамером они влияния не оказывают. Следовательно, для связывания СРБ-мономера и СРБ-пентамера не только макрофаги, но и нейтрофилы используют разные рецепторы.

Ассоциация клеток эндотелия аорты и коронарных артерий человека с СРБ-мономером происходит на плазматической мембране в местах формирования липидных рафтов (плотов), которые образованы из наиболее гидрофобных ФЛ (сфингомиелинов), а содержание в плазматической мембране ХС оказывает синергичное действие. Разрушение рафтов при инкубации с мета-|3-циклодекстрином или нистатином ингибирует действие СРБ-мономера, синтез и секрецию клетками цитокинов, продукцию N0, активных форм 02 и выставление молекул адгезии на плазматическую мембрану эндотелия.

 
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ     След >