Меню
Главная
Авторизация/Регистрация
 
Главная arrow Медицина arrow Геноидентификация вируса бычьего лейкоза

ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ БЫЧЬЕГО ЛЕЙКОЗА

На протяжении более века исследователи из разных государств мира изучали этиологию данного заболевания, но только 1969 год ознаменовался в истории изучения лейкоза годом открытия этиологического агента - вируса лейкоза крупного рогатого скота, или бычьего лейкозно-го вируса (Bovine Leukemia vims, BLV) [149].

Возбудитель лейкоза крупного рогатого скота - онкогенный вирус (РНК-содержащий) рода Oncovirus семейства Retroviridae [89, 114, 137, 151, 164]. Вирус бычьего лейкоза (ВБЛ) в морфологическом аспекте проявляет схожесть с возбудителями, вызывающими лейкоз у других видов животных. При этом антигенная структура вируса существенно отличается. Известен серовариант вируса, к которому помимо крупного рогатого скота восприимчивы еще овцы и козы.

По структуре и морфологии вирус бычьего лейкоза относится к типу С, а по онкогенным свойствам делится на три группы:

  • 1) медленнотрансформирующийся, или вирус хронического лейкоза;
  • 2) быстротрансформирующийся, или вирус острого лейкоза.
  • 3) трансрегулирующиеся вирусы (по структуре и морфологии вирусы схожи с вирусом иммунодефицита человека - ВИЧ).

Геном вируса бычьего лейкоза содержит гены, кодирующие как структурные белки (gag-ген), включая гликопротеид оболочки (е;?г-ген), так и обратную транскриптазу (/ю/-ген). Вирус имеет в своем геноме онкогены V-onco [20]. Согласно данным многих ученых, вирусные частицы (вирионы) имеют выраженный полиморфизм.

Большинство вирионов имеют сферическую форму диаметром 90-120 нм и состоят из сердцевины, внутренней белковой мембраны и липидосодержащей наружной мембраны. На поверхности внешней оболочки имеются пепломеры (шипики) с утолщением пуговкообразной формы на конце (8-11 нм), состоящие из субъединиц, которые образованы двумя типоспецифичными вирусными белками (gp51, gp30). В сердцевине различают капсулу сердцевины с икосаэдральной симметрией и нуклеоид, расположенный в центре вириона, размером 60-90 нм [54].

Структура вириона ВБЛ представлена на рис. А. Геном его составляют две ассоциированные молекулы РНК, которые с нуклеокапсидными и капсидными белками (Р24, Р15, Р12 и Р10) образуют капсид вириона.

Две копии одноцепочечной геномной РНК упакованы в вирусной частице. Капсидные белки СА (р24) формируют капсид, который содержит вирусную РНК, связанную с нуклеокапсидным белком NC (р 12). Матриксный белок МА (р 15) взаимодействует с капсидом и внешней оболочкой, которая формируется двойным липидным слоем клеточного происхождения с включенными в него вирусными гликопротеидами gp30 (ТМ) и gp51 (SU) [118].

А. Схематическое изображение вирусной частицы

Рис. А. Схематическое изображение вирусной частицы

Оболочка вириона образована компонентами клеточной мембраны с включенными в них вирусными гликопротеидами - gp51 и gp30. По аналогии с другими ретровирусами считается, что в капсиде должно быть немного обратной транскриптазы и интегразы, но филогенетическое сравнение различных ретровирусов показало, что ВБЛ образует среди них особую группу. Кроме того, обратная транскриптаза онкорна-вирусов имеет молекулярную массу 80 кДа и в одном вирионе присутствуют десятки этих молекул. Молекулярная масса ревертазы ВБЛ имеет такую же молекулярную массу, и, вероятнее всего, ее в вирионе ВБЛ нет [118].

Геном вируса может существовать в двух формах: геномной 1-цепочечной РНК или в виде ДНК, синтезированной на геномной РНК как на матрице и интегрированной в хромосому клетки-хозяина в виде провируса. Геномная РНК содержится только в зрелых вирионах. В зрелом вирионе содержится две молекулы РНК (рис. А). В жизненном цикле вируса геномная РНК функционирует лишь 1 раз, когда служит матрицей для фермента - обратной транскриптазы при биосинтезе комплементарной ДНК. Весь объем биохимических процессов, необходимый для полной репликации вируса, выполняется с участием ДНК-провиру-са [69].

Провирусная ДНК содержит около 9 тыс. нуклеотидных пар. В геноме ВБЛ различают гены gag, prt, pol, env, tax, rex, R3 и G4 (рис. Б). Кроме геномной РНК в процессе транскрипции путем альтернативного сплайсинга (вырезания определенных районов РНК-интронов) и сдвига рамок считывания образуются иРНК env (5,1 тыс.н.) иРНК gag-pol, иРНК tax/rex (2,1 тыс.н.) и немного в меньшем количестве - иРНК, ко-диоуюшие R3 и G4.

Б. Структура провируса ВБЛ

Рис. Б. Структура провируса ВБЛ: гены, РНК-транскрипты и вирусные белки

Провирус ограничен двумя идентичными последовательностями длинных концевых повторов (LTRs) и содержит открытые рамки считывания (ORFs), соответствующие gag, prt (протеаза), pol и env генам. Ряд ORFs, кодирующих Tax, Rex, R3 и G4, присутствуют в Х-регионе между геном env и 3' LTR [118].

На обоих концах молекулы содержатся последовательности нуклеотидов, называемые LTR (Long Terminal Repeat) - длинные концевые повторы, которые состоят из трех регионов: U3 - уникальная последовательность нуклеотидов (358 п.н.), R- повторяющиеся последовательности (100 п.н.) и U5 - уникальные последовательности нуклеотидов (180 п.н.).

Транскрипция геномной РНК начинается с первого нуклеотида в R-районе 5' LTR и заканчивается последним нуклеотидом в R-районе 3' LTR.

Регион U3 5' LTR - регуляторный район транскрипции вирусной РНК. Ключевым регуляторным районом является тройной повтор в 21 п.н. (TxRE), он находится в середине LTR и взаимодействует с клеточными факторами траскрипции - CREB (белок, связывающий элемент, реагирующий с циклической АМФ), ATF-1 и ATF-2. Этот же сайт LTR является мишенью для белка Tax, активатора вирусной транскрипции, который укрепляет связь CREB с ДНК [184].

Есть и другие элементы в U3 районе, участвующие в регуляции транскрипции вирусных РНК. Среди них - NF-кВ-связывающий сайт (ядерный фактор каппа белков), с которым связываются члены семейства каппа-В-белков (р49, р50 и р65) [90, 154]. Другой элемент необходим для ответной реакции LTR промотора к глюкокортикоидам [182, 107].

В U5 районе есть сайт связывания интерферон-регуляторных факторов (IRF-1 и IRF-2), которые стимулируют транскрипцию в отсутствии белка Tax. Есть последовательности нуклеотидов и в R-районе 5' LTR, которые участвуют в регуляции транскрипции.

За точкой старта транскрипции локализован Е-бокс мотив (5'-Ц-А-Ц-Г-Т-Г-3'), связывающий стимуляторные факторы транскрипции клетки -USF-1 и USF-2, которые подавляют LTR-направляемую экспрессию.

Кроме того, вирусная экспрессия регулируется и путем модификации активности клеточной ДНК, например, с помощью ацетилирования гистонов и метилирования ДНК.

Так же, как и клеточная, вирусная экспрессия регулируется и на посттранскрипционном уровне, например, вирусным белком Rex, который взаимодействует с 3' LTR, что необходимо для экспорта из ядра в цитоплазму целых или односплайсированных вирусных транскриптов.

Транскрипция РНК с провирусной ДНК начинается с границы U2/R5' LTR и до последнего нуклеотида в R-районе 3' LTR, после чего она полиаденилируется. 3'-конец геномной РНК содержит высокоструктурированный район RxRE, который необходим для транспорта РНК-посредника из ядра в цитоплазму.

После выхода из ядра геномная РНК может стать матрицей для синтеза белка-предшественника Prl45gag'pt)l, из которого после расщепления образуются структурные и энзиматические белки (остальные вирусные белки, необходимые для репродукции вируса, образуются путем транскрипции встроенной вирусной ДНК в соответствующие им иРНК) или включаться в формирующиеся вирионы, если эти белки в клетке уже есть [73, 118].

Гены gag и протеазы. Ген gag кодирует белок-предшественник pr44gag _ полипептид, который впоследствии расщепляется на белки вирусной частицы (р 15, р24 и р 12) [130, 121, 141, 158, 171, 146].

Матриксные (МЛ) белки р15 связаны с геномной вирусной РНК, но также взаимодействуют и с двойным липидным слоем вирусной мембраны. Структурно МА содержат четыре основные спирали, которые соединены короткими петлями (цепочками) [105]. Матриксный белок может быть далее расщеплен на три фрагмента: полипептиды р 10, р4 и продукт из семи аминокислот [129].

Нуклеокапсид р12 - белок, тесно связанный с упакованной геномной РНК [130, 152].

р24, нейтральный и умеренно гидрофобный белок, является главным компонентом капсида вириона ВЬУ. Белок СА - главная мишень для иммунного ответа с высокими титрами антител, обнаруживаемыми в сыворотках инфицированных животных. Он имеет два сайта узнавания Т-лимфоцитами [140, 180]. Основываясь на использовании моноклональных антител, обнаружено, что капсидный белок ВЬУ имеет эпитоп (антигенную детерминанту), общий с СА НТЬУ, что предполагает эволюционное родство между этими двумя вирусами.

Протеолитическое расщепление Рг44§а§ осуществляет вирусная протеаза р14, которая кодируется областью ДНК между генами #а# и ро1. Белок р 14 синтезируется с предшественника ?Я?-протеазы Рг66ёаё'рг1, который транскрибируется путем сдвига рамки считывания гена gag. Несмотря на эволюционное родство, протеазы ВЬУ и НТЬУ обладают специфичностью в узнавании мест расщепления [177].

Ген ро1. Ген ро1 транслируется путем сдвига рамки считывания в виде белка-предшественника 145 кДа [139]. Рг145 содержит все пептиды предшественника §а§-протеазы и, таким образом, представляет собой продукт элонгации Рг66ёаё'рп. Белок-предшественник 145 к Да расщепляется далее на белки Рг 66 кДа и Рг 80 кДа. Ген ро1 кодирует обратную транскриптазу (80 кДа). Среди многих своих функций, обратная транскриптаза (ревертаза) служит в качестве РНК-зависимой ДНК-полимера-зы (которая преимущественно активна в присутствии ионов 1У^2+) [87, 132], а ДНК-зависимая ДНК-полимераза, интеграза и РНКаза, каждая в меру своей определенной функции, представляют различную часть белковой молекулы [63]. Интеграза необходима для внедрения двунит-чатой вирусной ДНК в геном клетки хозяина [169, 108].

Ген епу. Ген епу кодирует белки оболочки ВЬУ. Он транскрибируется в иРНК (5,1 тыс.н.), кодирующую белок-предшественник Рг72С|П [129, 109, 141, 171, 146]. Оболочки ВЬУ и НТЬУ имеют в аминокислотной последовательности 36%-ную идентичность. Предшественник Рг72ет расщепляется на две субъединицы - поверхностный §р51 (БЫ) и трансмембранный gp30 (ТМ) белки, гликозилированные полипептиды [159, 160, 167, 128]. БЫ и ТМ соединяются дисульфидными связями, образуя относительно устойчивый (стабильный) комплекс [91]. Трансляция иРНК этого предшественника осуществляется, вероятно, на рибосомах шероховатого ретикулума, после чего такие белки гликозилируются или фосфорилируются, упаковываются в аппарате Гольджи и выносятся на поверхность клетки либо для встраивания их в мембрану, либо для экспорта из клетки.

Интересно, что Рг72с,п при делении клетки концентрируется в основном только в одной из дочерних клеток [130], тем самым, возможно, позволяя другой дочерней клетке уклоняться от сильного иммунного ответа, допуская, таким образом, персистенцию вируса в этих клетках [118].

В отличие от трансмембранных белков (ТМ), которые мало иммуногенны, БЫ индуцируют сильную экспрессию специфичных антител у инфицированных животных. Некоторые моноклональные антитела (F, G и Н), направленные против структурных эпитопов (антигенных детерминант) поверхностного белка SU, проявляют нейтрализующую активность [159, 99, 100]. Ни один из известных вирусных штаммов не лишен одновременно реактивности F, G и Н, говоря о том, что потеря этих трех антигенных детерминант, возможно, означает потерю инфекционности. Исследованиями показано, что антигенные детерминанты 39-48, 78-92, 144-157 и 177-192 также вовлечены в вирусную инфекционность [161, 117]. Интересно, что аминокислотные остатки 144-157 белка SU соответствуют региону оболочечного гликопротеида HTLV-1, который также участвует в нейтрализации. Слияние клеток, т.е. образование синцития, ингибируется сывороткой против пептидов 64-73, 98-117 и 177— 192. Эта последняя последовательность (в частности, аминокислотные остатки Р177 и D178 поверхностного белка SU), стимулирующая пролиферацию лимфоцитов, выделенных от инфицированных коров, является эпитопом Т-хелпера. С08-цитотоксичная активность связана с пептидами 121-140, 131-150 [122] или 24-31 [144, 126].

Трансмембранный белок ТМ является ключевым фактором в процессе слияния инфицированной клетки с новым лимфоцитом-мишенью [127, 176].

Гены R3 и G4 яг/ (открытые рамки считывания). Открытые рамки считывания принадлежат промежуточному региону, расположенному между генами env и tax/rex. Эти последовательности транскрибируются в иРНК, результатом трансляции которой являются белки 5,5 кДа (R3) и 11,6 кДа (G4). Белок R3 содержит 17 аминокислотных остатков, общих с белком Rex и 27 аминокислот - с R3 orf [ 142]. Белок R3, как и белок Rex, может быть вовлечен в посттранскрипционную регуляцию эспрессии вируса. R3 локализуется в ядре и клеточных мембранах, как и белок р 121 HTLV-1. Белок G4 располагается в ядре и митохондриях, подобно р 1 Зп HTLV-1 [131], и, возможно, участвует в трансформации клеток. R3 и G4 не обязательны для инфекционности in vivo, но интеграция этих генов важна для эффективной репродукции вируса в организме [86, 135, 163].

Ген Rex. Последовательности гех высоко консервативны среди различных изолятов ВЛКРС (менее 5% изменчивости) [103]. Продуктом этого гена является белок 18 кДа, образующийся путем сдвига рамки трансляции гена rex orf. Белок Rex имеет точечное ядерное расположение, связан с ядерными порами и участвует в посттранскрипционной регуляции.

иРНК Rex содержит 2,1 тыс. оснований и кодирует не только Rex, но и белок Tax. Экспрессия иРНК tax/rex, в отличие от других вирусных иРНК, поддерживается на последних стадиях лейкемии или лимфосар-комы [178].

7я.х-трансактиватор. Tax белок - другой протеин, кодируемый иРНК Rex (2,1 тыс. н.). Он является транскрипционным активатором экспрессии вируса. Tax orf - наибольший Х-регион, локализованный между геном env и 3’-концом LTR. Белок Tax - мишень для иммунного ответа с Т- и В-эпитопами, соответствующими районам 110-130/131-150 и 261-280, соответственно [156].

Белок Tax богат пролиновыми (13%) и лейциновыми (16%) остатками и имеет относительно короткий период жизни (5-6 часов) [162]. Он локализуется в цитозоле [179, 102]. Основная функция Tax - активация вирусной транскрипции. Этот механизм трансактивации требует взаимодействия с клеточными факторами транскрипции, такими как CREB. В этом он подобен белку G4. Таким образом, белок Tax - главный компонент, необходимый для репликации вируса и патогенеза. В нем различают два сайта - один, отвечающий за модуляцию транскрипции, другой - за онкогенность. Целостность tax гена необходима для вирусной инфекционности in vivo [86, 170].

Устойчивость. Известна чувствительность вируса к воздействиям температур: повторное замораживание и оттаивание или 15-минутное нагревание при 56°С убивает вирус. Вирус проявляет чувствительность к жирорастворителям, детергентам [66]. Пастеризация молока 16 с при 74°С разрушает вирус, теряется его инфекционность. Прямой солнечный свет инактивирует вирус в течение 4 ч, УФ лучи - в течение 30 мин (120 Вт на расстоянии 1 м). BLV полностью теряет активность в растворах едкого натра (0,5%, мин, 22°С), этанола (2,0%, 4 ч, 22°С), формальдегида (0,5%, 8 ч, 37°С), фенола (0,5%, мин, 4°С). В жидком азоте вирус в лимфоцитах сохраняет инфекционность в течение нескольких лет. В организме вирус способен длительное время локализоваться в клетке итерированным в геном хозяина, проявляя свое патогенное действие лишь при снижении иммунореактивности инфицированного животного [52].

Антигенная структура. Вирионный состав представлен шестью белками, четыре из которых являются негликозилированными, а два -гликозилированными, что установлено методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле и гельфильтрацией в присутствии гидрохлорида гуанидина.

Антигенная вариабельность и родство. В антигенном отношении BLV имеет отличия от других вирусных патогенов типа С. Так, не выявлено родства между белком р24 BLV и группоспецифическими антигенами вирусов лейкоза кошек, мышей и др. животных.

Локализация вируса, вирусоносительство, персистенция. Вирус бычьего лейкоза может быть выявлен в молозиве и молоке лактирую-щих животных. Однако не удалось выделить вирус из мочи, носовых истечений, слюны зараженных животных. Теленок, инфицированный до рождения или после естественным путем или экспериментально, остается зараженным на всю оставшуюся жизнь.

Структурные нарушения в клеточном геноме, предположительно, являются основной причиной для последующей опухолевой трансформации клеток. Неспособность антител элиминировать вирус может быть объяснена тем, что данный патоген, как правило, локализован в пораженных лимфоцитах. Инфицированные лимфоциты передают геном провируса своему потомству в процессе деления клеток. BLV может также передаваться от клетки к клетке, минуя стадию вирусных частиц, подобно герпесвирусному механизму клеточного прикосновения [69].

Антигенная активность. Зараженные BLV животные вырабатывают АТ к нескольким вирионным АГ. Для детекции АГ данного вируса был применен метод непрямой иммунофлюоресценции (ИФ), используя сыворотку животного, больного лейкозом. Так, в процессе исследований было установлено, что выявленные антигены представляют собой вирионные компоненты - антигенные детерминанты главного вирион-ного белка (р24). А в сыворотках крови от больных лейкозом коров были обнаружены комплементсвязывающие антитела (КСА) к четырем полипептидам вируса (р 15, р24, gp30, и gp51). В сыворотках же крови от ягнят и телят, родившихся от инфицированных лейкозом животных, регистрировались высокие уровни специфических АТ, которые сохранялись после рождения в течение 3 мес у ягнят и 6 мес у телят. Причем АТ, относящиеся к классам IgC, IgA и IgM, продуцируются в основном на белок gp51. Тем не менее наличие АТ все равно не предотвращает процесс развития опухолей [70].

Культивирование. Вирус бычьего лейкоза удалось впервые обнаружить в культурах инфицированных лимфоцитов крови. BLV размножается в перевиваемых культурах клеток от тканей разных видов животных. Перевиваемая линия FLK-BLV, полученная Van der Maaten в 1974 г., является самой распространенной линией клеток, созданной сокультивированием овечьих эмбриональных почечных клеток с лейкоцитами коровы, инфицированными вирусом [175]. Данная линия клеток широко применяется в серологических, биохимических и морфологических исследованиях. Другие перевиваемые линии клеток, хронически инфицированные вирусом бычьего лейкоза, такие как АИД-15 (фибробластов легкого эмбриона коровы), ПЭК (почек эмбриона коровы), Т61-Lu (легкого эмбриона летучей мыши), BLV-Simian (легкого макаки-резус), FLS (селезенки овцы), ТЭК-МВА-766 (тимуса эмбриона коровы), также нашли свое широкое применение [70].

 
Если Вы заметили ошибку в тексте выделите слово и нажмите Shift + Enter
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   След >
 

Популярные страницы