Материалы и методы исследования, используемые для изучения изменений в печени и поджелудочной железе у опытных животных
В наших исследованиях моделирование НПВП-индуцированного поражения печени и поджелудочной железы осуществлялось у нелинейных белых крыс двумя способами - пероральным введением нимесулида (Найз®) -препарата, используемого в клинической практике для лечения людей, и пероральным введением карпрофена (Римадил Р) - ветеринарного препарата. Препараты вводили в течение 21 дня на фоне обычного пищевого режима за 1 час до кормления.
В данной главе приведены результаты исследований с применением нимесулида.
Найз® («Д-р Редди’с Лабораторис Лтд.», Индия, г. Хайдерабад). Международное непатентованное название - нимесулид, химическая формула -4'-нитро-2'-фенокси-метан сульфонанилид, таблетки 100 мг.
При расчете однократных терапевтических доз для крыс здесь и далее использовался коэффициент пересчета равноэффективных доз для разных видов млекопитающих и человека по Laurence D.R. (Волчегорский Н.А., Долгушин Н.Н., Колесников О.Л., Цейликман В.Э., 2000).
Нимесулид вводили в следующих дозировках: 0,5 мг/кг (терапевтическая доза), 2,5 мг/кг и 5 мг/кг.
Таблетку препарата Найз® 100 мг делили пополам, 50 мг растворяли в 10 мл чистой дистиллированной воды, в результате получали раствор, содержащий 5 мг вещества в 1 мл. К полученному раствору добавляли 4,0 мл воды (концентрацию раствора уменьшали в 5 раз), в полученном растворе нимесулида содержалось 1 мг в 1 мл (доза 5 мг/кг). Далее 1 мл этого раствора разводили водой либо в 10 раз - получали раствор, содержащий в 1 мл 0,1 мг нимесулида (терапевтическая доза - 0,5 мг/кг), либо в 2 раза - получали раствор, содержащий в 1 мл 0,5 мг нимесулида (доза 2,5 мг/кг). Экспериментальным животным вводили по 1 мл полученных растворов.
Были сформированы экспериментальные группы по 10 животных в каждой:
I - контрольная группа - интактные животные, в течение всего эксперимента находящиеся в стандартных условиях экспериментально-биологической клиники (вивария) и получавшие стандартный рацион, п=10;
II — животные, получавшие в течение 21 дня per os нестероидный противовоспалительный препарат нимесулид в терапевтической дозе -0,5 мг/кг, п=10;
III - животные, получавшие в течение 21 дня per os нестероидный противовоспалительный препарат нимесулид в дозе 2,5 мг/кг, п=10;
IV - животные, получавшие в течение 21 дня per os нестероидный противовоспалительный препарат нимесулид в дозе 5 мг/кг, п=10.
Животные получали типовой рацион вивария в соответствии с нормативами, утвержденными приказом Минздрава СССР от 10 марта 1966 г. № 163 и Приказом Минздрава СССР от 10 октября 1983 г. № 1179 (п. 4.1):
- • комбикорм-концентрат гранулированный - 50,0 г;
- • творог обезжиренный - 6,0 г;
- • морковь - 20,0 г;
- • зелень из пророщенного овса - 15,0 г;
Итого кормов в рационе - 91,0 г.
Все эксперименты выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12 августа 1977 г. № 755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г. на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории Государственного учреждения высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения Российской Федерации (далее - ЦНИИ ГБОУ ВПО ПГМУ им. академика Е.А. Вагнера Минздрава России).
Ежедневное наблюдение за животными в условиях 2-х серий эксперимента включало регистрацию внешнего вида, поведения, физиологических функций. По окончании исследований животных выводили из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии.
Осуществляли забор органов для проведения гистологического исследования - печени и поджелудочной железы. Результаты, полученные при проведении гистологического исследования образцов тканей, полученных от животных экспериментальных групп, сравнивали с результатами, полученными при исследовании биоматериала, полученного от животных контрольной группы.
Морфологические исследования выполнены в отделе морфологических и патофизиологических исследований ЦНИЛ ГБОУ ВПО ПГМУ им. академика Е.А. Вагнера Минздрава России.
Объектом морфологических исследований являлись фрагменты органов животных (печени и поджелудочной железы).
Кусочки тканей, толщиной 5-7 мм, фиксировали в 10%-ном забуференном по Лилли формалине (pH - 7,2). Фиксированные в формалине биоптаты обезвоживали и обезжиривали в соответствие со стандартными гистологическими методиками, после чего осуществляли их заливку в гистамикс. С парафиновых блоков готовили серийные (5-10 шт.) срезы толщиной 3—5 мкм и помещали их на предметные стекла. В процессе исследований гистологические срезы депарафинировали по стандартным схемам.
Материалом для морфометрических исследований являлись образцы печени и поджелудочной железы животных; фиксацию материала и приготовление гистологических препаратов осуществляли по общепринятым методикам (Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996), срезы окрашивали
гематоксилином и эозином, а также с использованием дифференцированного окрашивания клеток островков Лангерганса по Бенсли в модификации Лилли.
Количественный (морфометрический) анализ исследуемых гистологических образцов проводили при помощи окуляр-микрометра и с использованием программного пакета BioVision (Австрия). Измерения гистологических объектов, осуществляемые при помощи окуляр-микрометра, проводили при увеличении микроскопа х 400. Цену деления окуляр-микрометра определяли, используя объект-микрометр (0,0042 мм). В каждом препарате проводили от 5 до 10 измерений, после чего вычисляли средние величины и стандартные отклонения для каждого случая и средние величины по группам.
Захват изображений обеспечивался использованием цифровой камеры для микроскопа САМ V200, Vision (Австрия). Размеры гистологических объектов выражали в мкм.
В поджелудочной железе измеряли размеры долек, ацинусов, ациноцитов, островков Лангерганса, панкреацитов, инсулоцитов и их ядер; определяли ядерно-цитоплазматическое соотношение в экзокриноцитах, поскольку оно может являться объективным критерием функционального состояния экзокринной части поджелудочной железы (Рядинская Н.И., Сиразиев Р.З., 2008). Также в поджелудочной железе определяли степень лимфоидноклеточной инфильтрации стромы (при помощи функции программного обеспечения BioVision «Сегментация по гистограмме»), наличие
и выраженность склеротических изменений (вычисление удельного объема соединительной ткани на тестовую единицу площади среза), изменение количества островков Лагнерганса, оценка показателей проводилась качественным и полуколичественным методами (Зубрицкий М.Г., 2006).
Проводя гистометрический анализ ткани печени, учитывали размеры долек, гепатоцитов, подсчитывали ядерно-цитоплазматическое соотношение в них, определяли выраженность склеротических изменений и лимфоидноклеточной инфильтрации стромы.
Линейные размеры гистологических структур определяли при помощи окуляр-микрометра. Подсчет количества клеток, измерение их размеров, вычисление объемных соотношений тканей — при помощи
специализированного программного пакета BioVision. Клеточную плотность и процентное соотношение клеток определяли при помощи программы BioVision с использованием функций «Сегментация по гистограмме» и «Сетка».
Статистический анализ выполнен при помощи программного пакета Biostat и приложения Microsoft Excel полнофункционального офисного пакета Microsoft Office 2007.
При проведении статистической обработки результатов экспериментальных исследований вычисляли выборочное среднее, стандартную ошибку и стандартное отклонение, сравнение между собой двух выборок. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в экспериментальных и клинических исследованиях принимали равным
р<0,05.
