Электронная микроскопия и способы приготовления срезов

Для детального изучения микроструктуры кишечного сырья, а также других материалов готовят гистологические препараты. Для этого используют различные методики заливки ткани в парафин и окрашивают препараты гематоксилином и эозином, а также по методу Ван-Гизона.

Приготовленные и окрашенные препараты тщательно изучают и фотографируют при помощи сканирующего микроскопа, например Reichert Jung Polivar (Австрия), при увеличении х80.

Заливка ткани в парафин

  • 1. Фиксация. Ввиду того что лишенные питания ткани организма очень быстро начинают претерпевать необратимые изменения, первым и обязательным условием микроскопической техники являются предупреждение и задержка посмертных изменений в тканях. Это достигается путем фиксации взятого для исследования материала:
    • • обработка формалином — 24 ч;
    • • промывание в проточной воде — 24 ч.

В основе действия фиксаторов лежат физико-химические процессы и в первую очередь процесс коагуляции белков.

  • 2. Обезвоживание. Для проведения этого процесса крепость спирта повышают ступенчато в целях предотвращения неравномерного обезвоживания внешних и внутренних слоев ткани. Применяют этиловый спирт:
    • • спирт 70° — 24 ч;
    • • спирт 96° — 24 ч;
    • • спирт 96° — 12 ч.

Необходимо учитывать, что спирты в процессе обезвоживания довольно быстро загрязняются экстрагируемыми из тканей веществами и особенно жирами. Не следует использовать длительное время одни и те же спирты. Необходимо своевременно их сменять.

3. Пропитывание. Обезвоженные и уплотненные кусочки перекладывают из абсолютного спирта в смесь абсолютного спирта с хлороформом (1 : 1) на 12 ч, а затем в чистый хлороформ на 12 ч, где они вначале плавают (выступая над его поверхностью), а затем по мере пропитывания постепенно погружаются. В процессе удаления спирта хлороформ меняют 2—3 раза на протяжении 1,5—3 ч. После этого, соблюдая принцип постепенного замещения хлороформа парафином, помещают объект в смесь из равных частей парафина (желательно мягкого (точка плавления 45—54 °С)) и хлороформа. Эта смесь, застывающая при комнатной температуре, при нагревании до 37°С расплавляется и приобретает жидкую консистенцию. Кусочки находятся в хлороформ-парафине при 37 °С в течение 12 ч.

В целях полного освобождения объекта от хлороформа кусочки проводят последовательно через 2—3 порции расплавленного парафина в течение 2 ч.

4. Заливка. Приготовление высококачественных гистологических препаратов требует наличия равномерно тонких срезов с исследуемого объекта. Для того чтобы их получить, кусочки тканей заливают такой средой, которая способна превратить их в хорошо режущуюся массу. В большинстве случаев для заливки применяют парафин с точкой плавления 54—56 °С.

Заливка осуществляется следующим образом. Предназначенный для заливки парафин подогревают до 58-60 °С и аккуратно наливают в приготовленную формочку, заполняя ее до самых краев и избегая образования пузырьков воздуха. Затем подогревают пинцет или металлический шпатель, быстро переносят подготовленный к заливке объект в формочку с парафином и ориентируют в необходимом положении. После этого формочку охлаждают водой (10—18 °С).

В процессе застывания поверхность блока кратерообразно стягивается, что необходимо учитывать при выборе высоты формы. Если форма недостаточно высокая или залита не полностью и парафин лишь тонким слоем покрывает объект, то при застывании верхняя часть кусочка будет выступать из блока. Из залитой в парафин ткани приготавливают срезы на санном микротоме марки СМ-1.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >