ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучение и усвоение материалов, изложенных в гл. 1, позволит:

знать:

S роль дисциплины в формировании ветеринарно-санитарного эксперта;

S подготовку образцов сырья и продуктов животноводства и растениеводства для гистологических исследований;

S методы подготовки препаратов для исследований при оптической и электронной микроскопии;

S особенности структур клеток и тканей, окрашивающиеся гистологическими красителями;

уметь:

S микроскопировать гистологические препараты, свободно идентифицируя клетки тканей и органов на светооптическом уровне и электронограммах;

S проводить гистологические исследования и правильно интерпретировать результаты лабораторной диагностики;

S проводить ветеринарно-санитарную экспертизу сырья и продуктов животноводства и растениеводства с применением оптической микроскопии; владеть:

S техникой проведения анализа гистологических объектов на микроскопическом и субмикроскопическом уровнях.

Ключевые слова: гистологический препарат; микроскопия; оптический микроскоп; электронный микроскоп.

МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА

Для изучения микроскопической структуры сырья и продуктов животного происхождения в практических лабораториях, как правило, используют световую (оптическую) микроскопию.

В световом микроскопе различают механические и осветительные части, объединенные штативом, и оптическую систему.

Механическая часть микроскопа состоит из подставки, тубуса, кремальеры, микрометрического винта, револьвера, предметного столика, зажима. Для придания устойчивости инструменту служит подставка. Тубус — полая трубка с оптическими линзами (сверху окуляр, внизу объектив). Кремальера, или винт для передвижения тубуса, имеется по обе стороны микроскопа (рис. 1).

Микрометрический винт служит для тонкого передвижения тубуса, в разных моделях расположен и устроен различно. Это самая

Рис. 1 [8]. Общий вид оптического микроскопа МБИ-1:

  • 1 — окуляр; 2 — тубус; 3 — револьверная система с объективами; 4 — предметный столик; 5 — препарат; 6 — конденсор с ирисовой диафрагмой; 7 — зеркало;
  • 8 — микрометрический винт; 9 — винт для передвижения тубуса

тонкая деталь в штативе, которую легко испортить небрежным обращением, поэтому микрометрический винт поворачивают не более чем наполовину оборота. Необходимо помнить, что при затруднении в работе микрометрического винта нельзя преодолевать тугость винта, применяя силу. Револьвер — вращающееся приспособление, имеющие два—четыре «гнезда» для ввинчивания объективов с разным увеличением; вращение револьвера позволяет быстро менять объективы в процессе работы. Предметный столик используется для объекта, отверстие предметного столика находится по оси тубуса. Зажимы (клеммы) — две пружинящие пластинки, держатели которых вставляются в отверстия предметного столика; служат для фиксирования препарата.

Осветительная часть микроскопа, или осветительный аппарат, содержит зеркало, диафрагму, рычажок ирис-диафрагмы, и конденсор, так называемый осветитель. Зеркало укреплено так, что ему можно придать любое положение, нужное для направления света через отверстие предметного столика на объект. Диафрагма позволяет равномерно суживать и расширять отверстие для прохождения световых лучей, тем самым регулируя освещение объекта. Такая диафрагма состоит из системы кривых тонких пластинок, надвигающихся одна на другую и расположенных в кольце, привинченном снизу к конденсору. Сбоку от этого кольца располагается рычажок диафрагмы, а под диафрагмой — кольцо для светофильтра, вращающееся в горизонтальной плоскости. В это кольцо вставляются светофильтры — обычно матовый бесцветный светофильтр, создающий равномерный рассеянный свет, и матово-синий, дающий при употреблении электрического освещения свет, приближающийся к естественному освещению. Конденсор (от лат. condense — уплотняю) — плоско-выпуклая линза, закрепленная в особом кольце, передвигающемся вниз и вверх. Конденсор служит для концентрации световых лучей на объекте и необходим при работе с сильными объективами.

Оптическая часть микроскопа образована оптическими линзами, образующими две системы: окуляр — система линз, с помощью которых рассматривается в увеличенном виде изображение, даваемое объективом; объектив — система линз, дающая непосредственное, первичное увеличение объекта. Окуляры (от лат. okulis — глаз) бывают слабыми, средними и сильными. Наиболее употребительными окулярами микроскопов являются: х5, х7 (слабый), х10 (средний), х15, х20 (сильный). Объективы (от лат. object — предмет); представляют собой различно скомбинированные системы линз; обязательной частью этих систем является плоско-выпуклая фронтальная (направленная к объекту) линза, диаметр которой тем меньше, чем больше увеличение, даваемое объективом. Увеличение объективов, как и окуляров, разделяют на категории: х10 (слабый), х20 (средний), х40 (сильный), х90 (очень сильный), помимо этих цифр помечается еще так называемая апертура, показывающая степень разрешающей способности объектива (от 0,30 у слабых до 1,25 или 1,30 у сильных). Увеличение объекта определяется произведением увеличения, даваемого объективом, на увеличение, даваемое окуляром. Надо иметь в виду, что объект увеличивает только объектив, окуляр лишь растягивает изображение, даваемое объективом. Следовательно, для получения большего увеличения всегда надо предпочесть более сильный объектив, а не окуляр.

По конструкции и способу применения объективы делятся на сухие (х10, х20, х40) и иммерсионные (х60, х90). При сухих объективах между фронтальной линзой объектива и препаратом находится воздух.

Иммерсионная микроскопия используется при исследовании микроорганизмов, для выявления которых пространство между объектом и объективом заполняется прозрачной жидкостью — иммерсионным маслом. Связано это с тем, что стекло имеет показатель преломления света, который отличается от показателя преломления воздуха, поэтому при сильных увеличениях объектива большинство световых лучей отклоняется, не попадая в объектив, отчего поле зрения темное. Поэтому наиболее сильные объективы конструируются с расчетом на помещение между фронтальной линзой и стеклом препарата такой среды, которая имела бы показатель преломления, близкий к стеклу. В качестве такой среды используют кедровое масло: капля этого масла наносится на препарат, объектив погружается в каплю, лучи света, выходя из стекла, уже не отклоняются, попадают в объектив, поэтому поле зрения оказывается хорошо освещенным. Масло с иммерсионных объективов лучше всего смывается серным эфиром.

В настоящее время в биотехнологии в зависимости от оптической системы используют фазово-контрастную, поляризационную, ультрафиолетовую, флуоресцентную микроскопию.

Фазово-контрастная микроскопия используется для исследования культур клеток и тканей, являющихся прозрачными.

Поляризационная микроскопия позволяет усилить контраст, за счет использование светофильтров, позволяющих полностью или частично гасить проходящий свет.

Ультрафиолетовая микроскопия позволяет получить большее увеличение за счет использования ультрафиолетового света меньшей длины волны (0,2 мкм).

Флуоресцентная микроскопия основана на свечении объекта — люминесценции (от лат. lumen — свет и escent — суффикс, означающий слабое действие). Флуоресценция (кратковременное свечение) вызывается особыми красителями (флуорохромами), которые, взаимодействуя с различными компонентами клетки, вызывают специфическое свечение соответствующих структур (рис. 2, а).

Для более детального исследования структуры клеток и тканей используют два вида электронных микроскопа: просвечивающий и сканирующий. Просвечивающий (трансмиссионный) микроскоп в общих чертах напоминает световой, но вместо светового пучка в нем используется поток электронов. Благодаря этому разрешение электронного микроскопа в 100 раз выше, чем светового. Сканирующий (растровый) микроскоп позволяет получать трехмерное изображение исследуемого объекта, так как электронный луч не проходит через образец, а отражается от него и преобразуется в изображение (рис. 2, б). Для этого поверхность препарата покрывают (напыляют) тончайшим (примерно 20 нм) слоем металла — золота или платины.

Для количественного анализа применяют спектрофотометр, авторадиографию, центрифугирование. Спектрофотометр (от греч. spectrum — образ; photos — свет; metreo — измеряю) — оптический прибор для измерений отношений интенсивности световых потоков в зависимости от длины волны света. Например, можно оценить сухую массу и концентрацию плотных веществ живой и фиксированной клетки. Авторадиография — метод регистрации меченных изотопами веществ, применяется для изучения метаболизма, внутриклеточного транспорта веществ, синтеза биополимеров. Для этого в ткань животного или среду с культивируемыми клетками вводят

[8]. Микроскопические методы исследований

Рис. 2 [8]. Микроскопические методы исследований: а — флуоресцентная микроскопия: 7 — молекулы РНК, 2 — молекулы ДНК,

3 — бактериальные клетки на поверхности эпителиальных клеток; 4 — злокачественные раковые эпителиальные клетки; х250; б — сканирующая электронная микроскопия: адгезия бактерий к эритроцитам; хЗО 000

предшественников какого-либо соединения, например аминокислоты, где один из элементов (водород, углерод, сера, фосфор) замещен радиоактивным изотопом. Центрифугирование (от лат. centrum — центр, fugo — бег) — разделение неоднородных систем при помощи центробежных сил. Принцип основан на том, что частицы оседают под действием центробежных сил при вращении пробирок с огромными скоростями, время оседания частиц во взвеси зависит от размера и плотности.

Правила работы с оптическим микроскопом. Приступая к работе с микроскопом, прежде всего необходимо проверить зеркало (должно быть вогнутым) и револьвер (должен иметь слабый объектив х10, замкнут на засечку). После этого надо выполнить действия в следующей последовательности:

  • • поставить микроскоп у края стола, так чтобы не приходилось к нему тянуться; если у микроскопа вертикальный тубус, надо наклонить его так, чтобы окуляр был на уровне глаза наблюдателя;
  • • установить освещение при слабом объективе, повернув зеркало так, чтобы поле зрения было освещено равномерно и достаточно ярко, но чтобы свет не раздражал глаза. При слабом увеличении осветительный аппарат (конденсор) опускается вниз;
  • • положить препарат на предметный столик, чтобы покровное стекло препарата было сверху; объект должен располагаться напротив отверстия столика;
  • • движением кремальеры найти фокус слабого увеличения (свободное расстояние около 1 см). Рассмотреть препарат при слабом увеличении, найти на препарате и поставить в центр поля зрения участок для детального изучения, после чего закрепить препарат зажимами;
  • • одной рукой придерживая за рукоятку микроскопа, другой рукой повернуть револьвер на сильный объектив, проверив замыкание засечки револьвера;
  • • при сильном увеличении осветительный аппарат (конденсор) поднимается; наблюдая в окуляр, необходимо найти такие благоприятные условия освещения, при которых детали препарата выступают наиболее отчетливо. Диафрагма всегда должны быть прикрыта настолько, чтобы дать наибольшую контрастность контурам микроскопических структур;
  • • наблюдая в окуляр, поднять объектив и острожным движением кремальеры установить фокус сильного увеличения (в большинстве случаев надо слегка поднять тубус) и микрометрическим винтом сфокусировать объект;
  • • рассмотреть препарат при сильном увеличении, вращая слегка микрометрический винт на четверть оборота, так как объект имеет различную толщину. Чтобы рассмотреть строение препарата в глубоких слоях и проследить за изменяющимися контурами структуры, необходимо слегка вращать микрометрический винт в обе стороны. Поэтому во время наблюдения в микроскоп одна рука должна все время находиться на микрометрическом винте и слегка двигать его в обе стороны;
  • • основное внимание на лабораторных занятиях необходимо уделять зарисовке гистологических препаратов. Зарисовки рекомендуется делать в альбомах цветными карандашами, соблюдая масштаб и действительные цвета препарата. Изучение и зарисовку препарата обязательно начинают при слабом увеличении микроскопа. Весьма важно учитывать при этом направление среза, в большинстве случаев необходимо найти в препарате такое место, где ткани разрезаны вертикально. Если необходимо выявить структуру отдельной клетки, то необходимо, чтобы плоскость гистологического среза пришлась прямо по центру;
  • • следует помнить, что в микроскопе получается обратное изображение, поэтому, желая рассмотреть деталь в правой части препарата, нужно подвинуть препарат налево, а желая подвести верхнюю часть препарата — передвинуть вниз. Изображение в микроскопе получается увеличенным, передвигать препарат необходимо медленно и плавно, иначе нужная деталь препарата выйдет сразу за пределы поля зрения микроскопа;
  • • по окончании наблюдения и зарисовки препарата следует поднять тубус, перевести револьвер на слабое увеличение и только тогда освободить зажимы и снять препарат со столика микроскопа. Не рекомендуется применять диагональные винты предметного столика для передвижения препарата; его нужно двигать рукой, используя диагональные винты только для центрировки нужного места.

Морфометрические исследования. Структуры клеток и тканей можно измерить с помощью окулярной линейки — микрометра или окулярного винтового микрометра, размеры выражают в микрометрах.

Окулярный микрометр представляет собой круглую стеклянную пластинку, в центре которой выгравирована линейка (длиной 5 мм), разделенная на 50 частей. Окулярный микрометр вставляют в окуляр делениями вниз. Величину структур клеток и тканей рассматривают через объектив и окуляр, поэтому прежде чем приступить к измерению величины клеток, необходимо определить цену деления окулярного микрометра для данного увеличения микроскопа. Указанную величину определяют с помощью объективного микрометра, представляющего собой металлическую пластинку с отверстием в центре. В отверстие вставлено стекло, на которое нанесена линейка длиной 1 мм, разделенная на 100 частей.

Таким образом, деление объективного микрометра соответствует 0,01 мм, или 10,0 мкм. Для определения цены делений окулярного микрометра объективный микрометр помещают на столик микроскопа и фокусируют при малом увеличении. Изображение линейки перемещают в центр поля зрения и только после этого меняют объектив на тот, при котором будут определяться размеры структур клеток и тканей. Перемещая предметный столик и поворачивая окуляр, устанавливают микрометры так, чтобы шкалы были параллельны, и одна перекрывала другую.

Цену деления окулярного микрометра определяют, совмещая одно из делений шкалы окулярного и объективного микрометров, и находят следующее их совмещение. Устанавливают, скольким делениям объективного микрометра соответствует одно деление окулярного микрометра. Например, два деления микрометра (20 мкм) соответствуют пяти делениям окулярного микрометра, следовательно, одно деление окулярного микрометра равняется 4 мкм (20:5). Положив на предметный столик препарат, можно определить размеры структур клеток и тканей. Для этого определяют, какому числу делений окулярной линейки соответствует величина измеряемого объекта, и умножают это число на цену деления окулярного микрометра. Чтобы результаты были достоверными, необходимо измерить не менее 20-30 клеток. При определении округлой формы структур измеряют диаметр, у других — длину и ширину, указывают средние размеры и пределы колебаний, т.е. минимальные и максимальные размеры.

Измерение микроскопических объектов проводят морфометрическими методами с последующей математической обработкой цифрового материала.

Контрольные вопросы

  • 1. Какое устройство имеет оптический микроскоп?
  • 2. Каковы отличия фазово-контрастной, темнопольной, поляризационной микроскопии?
  • 3. В чем особенность флуоресцентной микроскопии?
  • 4. Охарактеризуйте принцип работы спектрофотометра.
  • 5. С какой целью используют авторадиографию, центрифугирование?
  • 6. Каковы особенности просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии?
  • 7. Как определить цену деления окулярного микрометра?
 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >