АДАПТИВНЫЕ РЕАКЦИИ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Реакция на стрессовые воздействия

Как следует из предшествующего изложения, существует множество физических и химических факторов, которые могут оказывать на бактериальную клетку неблагоприятное действие. В процессе эволюции бактерии так же, как и любые другие живые организмы, приспособились к существованию в условиях, не вполне оптимальных, а иногда и таящих опасность для жизни. Токсические вещества, неблагоприятная температура, pH, облучение в пределах, определяемых видовой или штаммовой чувствительностью организма, не препятствуют нормальному существованию бактерий. Резкие изменения условий в неблагоприятную сторону приводят к отмиранию клеток. Однако при некоторых воздействиях, которые обычно обозначают как сублетальные, клетки не погибают сразу, но оказываются травмированными. Их дальнейшая судьба в значительной степени зависит от условий, в которых они окажутся. Травмирование клеток происходит под влиянием повышенной или пониженной температуры, под действием токсических веществ в невысоких концентрациях, в результате голодания, при осмотическом шоке, облучениях. У травмированных клеток во многих случаях нарушаются барьерные функции мембран, наблюдается выход в среду некоторых метаболитов, нарушается синтез белка, возникают нарушения в структуре ДНК. Некоторые условия, вполне благоприятные для развития нормальных бактерий, могут быть гибельными для травмированных клеток. Так, например, бактерии, подвергнутые сублетальному температурному шоку, осмотическому шоку и другим воздействиям, гибнут на средах с повышенной концентрацией солей, совершенно не опасной для нормальных клеток, или на средах с поверхностно-активными соединениями в концентрациях, также не влияющих на рост нормальных клеток. Эти факторы иногда определяют как селектирующие здоровые клетки от травмированных. В качестве таких факторов могут выступать pH, температура, даже определенные пищевые субстраты.

Травмированные клетки, помещенные в благоприятные условия, способны репарировать, т. е. исправлять повреждения различных структур. Наибольшее внимание исследователей в последнее время было привлечено к изучению механизмов восстановления повреждений ДНК. Что же касается репараций повреждений других структур клетки, то их механизмы еще практически не изучены. Известно, что для репарации функций мембран требуется значительное время, и их восстановление связано с синтезом белка и РНК, а также и фосфолипидов. В различных случаях благоприятные для репарации условия могут различаться. Например, иногда репарация идет лучше в богатых, а иногда в бедных средах. Это справедливо и для репарации повреждений ДНК.

Известен ряд систем репарации повреждений ДНК. Эти системы специфичны не в отношении воздействий, а в определенных нарушениях структуры ДНК. Однако, поскольку определенные воздействия преимущественно вызывают характерные для них нарушения структуры, при воздействии разными излучениями, мутагенами и т. п. ведущее значение приобретают те или иные системы репарации.

Фотореактивация наблюдается при освещении клеток видимым или ближним УФ-светом и состоит в разрезании пиримидиновых димеров в ДНК. Последние возникают обычно при воздействии на клетки среднего или дальнего УФ, поэтому особое значение фотореактивация имеет именно при воздействии УФ. Процесс фотореактивации связан с действием фермента фотолиазы, являющейся флавопротеином. Фотолиаза связывается с пиримидиновыми димерами, активация фермент-субстратного комплекса светом длиной волны 300 - 600 нм приводит к мономеризации димеров. Корреляции между общей радиорезистентностью клетки и способностью к фотореактивации не наблюдается.

Наряду с описанной прямой имеет место непрямая фотореактивация с пиком в области 340 нм. Этот эффект не связан с расщеплением димеров. Снижение эффекта УФ-облучения в этом случае объясняется задержкой роста бактерий, в результате чего удлиняется период протекания репарационных процессов. Непрямая фотореактивация, таким образом, не связана с работой каких-либо специальных репарационных систем.

Эксцизионная репарация состоит в удалении поврежденного участка ДНК одной цепи и восстановлении нормальной последовательности оснований по матрице оснований на комплементарной цепи. Вырезание повреждений осуществляется либо непосредственно эндонуклеазой, которая узнает нарушения, либо последовательным действием гликозилазы и ану- рин/апиримидиновой эндонуклеазы (АР-эндонуклеазы). У Е. coli эта функция выполняется комплексом эндуклеаз, кодируемых генами uvr А, uvr В, uvr С. Они вырезают олигонуклеотиды из 12 - 13 оснований. На следующей стадии репарации работает фермент хеликаза II (ген. uvr D), ДНК-полимераза (ген в pol А) и лигаза (ген lig). Е. coli обладает также рядом АР-эндонуклеаз.

Рекомбинационная репарация, т. е. репарация, включающая рекомбинацию, у Е. coli представлена 2 типами. Во-первых, это репарация, при которой заполняется пробел в последовательности оснований во вновь синтезированной цепи на месте поврежденного участка. Этот процесс определяется по крайней мере 4 генами. Во-вторых, существует процесс связанного с репликацией восстановления двунитевых разрывов в ДНК, возникающих под действием УФ, ионизирующей радиации, митомицина, тоже определяемый активностью нескольких генов.

В репарации повреждений ДНК у Е. coli участвует также фермент ме- тилтрансфераза, удаляющая метальные группы от Об-метилгуанина и О4- метилтимина и фосфодиэфирных остатков в ДНК (ген ada, играющий роль в адаптивном ответе).

Травмированные клетки не просто восстанавливают по возможности причиненные им повреждения. Под влиянием сублетальных воздействий неблагоприятных факторов происходят перестройки в процессах обмена веществ клетки, имеющие очевидное адаптивное значение. Более того воздействие неблагоприятных условий нередко вызывает ответную реакцию клетки, еще не приводя к каким-либо нарушениям ее структуры. Принято говорить, что клетки, подвергшиеся неблагоприятным воздействиям, находятся в состоянии стресса. В различных случаях это состояние может быть связано или не связано с нарушениями клеточных структур, т. е. клетки могут быть или не быть травмированы. Воздействия, которые приводят клетки в состояние стресса, определяют как стрессорные. Понятие стресса было сформулировано применительно к организмам, имеющим нервную систему, поэтому некоторые исследователи считают недопустимым применение этого термина к бактериям. Однако в современной микробиологической литературе термины «стресс» и «стрессор» используются очень широко.

Процессы, протекающие в клетках, находящихся в состоянии стресса, изучены преимущественно на модели кишечных бактерии, прежде всего Е. coli и Salmonella lyphimuriurn.

В зависимости от природы стрессора и характера причиненных повреждений реакция клетки может быть различной. У кишечных бактерий выявлено 5 регуляторных систем ответа на стрессовые воздействия:

1) строгий контроль; 2) SOS-ответ; 3) адаптивный ответ; 4) синтез белков теплового шока; 5) ответ на окислительный стресс. Во всех перечисленных случаях происходят глубокие перестройки метаболизма, связанные с замедлением или прекращением размножения и синтезом белков, необходимых для выживания. В некоторых случаях в процессах регуляции участвуют специальные соединения - клеточные гормоны, получившие название алармонов (фр. alarme - тревога). Перечисленные системы находятся под контролем соответствующих генов и взаимосвязаны.

Система строгого контроля включается главным образом в ответ на исключение из среды необходимых клетке аминокислот, источника углерода, солевой шок, инактивацию аминоацил-, тРНК-синтетаз, падение температуры, например у некоторых термофильных бактерий. При этом клетки могут и не травмироваться.

Система строгого контроля регулируется продуктом гена rel А синте- тазой алармонов: гуанозин-5-дифосфат-З-дифосфата (ppGpp) и гуанозин- 5’-трифосфат-3’-дифосфата. У разных бактерий свойства этого фермента могут несколько различаться. Синтетаза I, характерная для кишечных бактерий и некоторых термофильных бактерий, активна только в комплексе с рибосомами, иРНК и специфически связанной с соответствующим кодоном тРНК. У бацилл обнаружена синтетаза II, для активности которой образование подобного комплекса не требуется.

Положительный контроль предполагает включение системы при накоплении продукта регуляторного гена. Повышение содержания алармонов в результате активности синтетазы приводит к ингибированию синтеза иРНК, тРНК, и некоторых рРНК, в результате снижается синтез фосфаги- дилэтаноламина и соответственно мембранных липидов и нуклеотидов. Снижение уровня метаболизма способствует выживанию клетки в условиях, не допускающих сбалансированный обмен.

Система SOS-ответа включается при разнообразных нарушениях в структуре ДНК или в системах ее репликации. Для развития SOS-ответа существенное значение имеет образование однонитевой ДНК. Эта система работает, например, после УФ-облучения, воздействия различными химическими мутагенами. В состав SOS-системы входит ген lex А, продуктом которого является белок Lex А - репрессор ряда генов, и ген гес А, кодирующий полифункциональный белок Rec А. Белок Rec А, активированный сигналом-индуктором SOS-системы, приобретает свойства протеазы и инактивирует репрессорный белок Lex А. Природа сигнала, действующего на белок Rec А, пока не установлена. В результате разрушения белка Lex А снимается репрессия по крайней мере с 17 генов.

Белок Rec А не только обладает активностью протеазы, но и катализирует ряд процессов, в том числе перенос нитей от одной молекулы ДНК к другой, т. е. участвует в рекомбинации. Возможно, он участвует и в процессах репарации ДНК. В протеазной и других активностях белка Rec А кофактором выступают полинуклеотидные последовательности, т. е. од- нонитевая ДНК. Связываясь с ней, белок Rec А участвует в ренатурации ДНК.

Ген lex А авторегулируемый, т. е. репрессируется собственным продуктом, это обеспечивает постоянство концентрации белка Lex А в процессе размножения бактерий. 80% Lex А-белка разрушается за 3 минуты после УФ-облучения.

Гены, репрессируемые Lex А, имеют участки со сходными последовательностями оснований, хотя прочность связи с ними репрессора различна. У E.coli имеются конститутивные и индуцибельные системы репарации повреждений ДНК, в данном случае включается индуцибель- ная система. При SOS-ответе функционирует также пострепликативная система репарации, при которой повышена частота мутаций. Ген umu С, а также репрессируемый Lex А, определяют индуцированный мутагенез. Можно предпологать, что стимуляция мутагенеза в процессе SOS-ответа имеет приспособительное значение - могут появиться мутанты, более приспособленные к условиям, индуцировавшим SOS-ответ.

В процессе SOS-ответа можно выделить 3 фазы. В первой фазе подавляется синтез ДНК и происходит ее частичная деградация в ответ на образование белка Rec А. Во второй фазе синтез ДНК протекает с нормальной скоростью, но вновь синтезируемая ДНК содержит пробелы, которые восстанавливаются в процессе пострепликативной или рекомбинационной репарации. В это же время погибают клетки, нарушения в ДНК которых слишком значительны. Их гибель связана с действием продукта гена гес А и является проявлением одной из функций SOS-системы. У мутантов с неработающей SOS-системой клетки с подобными нарушениями в ДНК могут еще некоторое время существовать и даже приступать к делению, однако в процессе размножения они неизбежно обречены на гибель. Очевидно, что запрограммированное уничтожение неполноценных клеток выгодно для существования популяции, так как такие клетки сразу исключаются из числа потребителей пищи. Этот пример служит свидетельством существования у прокариот совершенных и тонких регуляторных механизмов, обеспечивающих виду успех в борьбе за существование. В третьей фазе в клетках начинается нормальный синтез ДНК, завершаются процессы репарации ДНК, а клетки переходят к нормальному росту.

У Е. coli через 30 минут после сублетального УФ-облучения синтез нРНК Rec А начинает снижаться, но примерно через 60 минут клетка возвращается к исходному состоянию.

Наличие SOS-системы обнаружено у различных представителей семейства Enterobacteriaccae, у Streptococcus faecalis, Bacillus subtulis. У последней при SOS-ответе, кроме того, развивается компетентное состояние клеток, т. е. они приобретают способность воспринимать экзогенную ДНК в процессе генетической трансформации.

Система адаптивного ответа клетки - индуцибельная антимутаген- ная система репарации. Облучение и мутагены в низких дозах вызывают снижение частоты мутаций при последующих воздействиях. При облучении в дозе 12,5 - 50 рад клетка в состоянии проявить защитный эффект в отношении последующего массированного облучения в дозах порядка 2 - 103 рад. Частота мутаций у Е. coli возрастает эффективно лишь в первый момент инкубации в присутствии мутагена нитрозогуанидина. По мере инкубации в присутствии мутагена частота мутаций падает, причем после индукции этой антимутагенной функции клетки становятся устойчивыми к нитрозогуанидину в концентрации в 100 раз выше первоначальной. При удалении нитрозогуанидина из культуральной среды через 4 часа индуцибельная антимутагенная функция полностью исчезает. Количество первичных нарушений ДНК при действии системы адаптивного ответа не изменяется, эффект зависит от индуцибельного репарационного процесса. Индукция системы происходит при концентрациях мутагенов в 10 - 100 раз меньших, чем необходимые для проявления их мутагенного действия. Система адаптивного ответа непосредственно не связана с SOS-системой и индуцируется различными воздействиями. Так, УФ-облучение вызывает SOS-ответ, но не адаптивный ответ.

Таким образом, у E.coli имеется индуцибельная система, увеличивающая частоту мутаций (SOS-ответ), и антимутагенная система. Индуктором и субстратом первой индуцибельцой системы служат достаточно грубые повреждения, блокирующие синтез ДНК при работе конститутивных полимераз. Антимутагенная репарационная система индуцируется другими типами повреждений, которые, вероятно, не связаны с блоком репликации ДНК, но приводят к возникновению мутации в момент репликации.

Синтез белков теплового шока (БТШ) вызывается сублетальным температурным шоком. При этом наблюдается быстрое изменение скорости синтеза большинства из 1000 белков, выявляемых в клетках Е. coli при помощи двухмерного электрофореза. Синтез некоторых белков прекращается, тогда как синтез БТШ усиливается более чем в 20 раз. Однако синтез некоторых из этих белков может стимулироваться и в других случаях, не только тепловым шоком, поэтому название БТШ является не вполне удачным.

У Е. coli выявлено 14 основных белков теплового шока. Функции этих белков неизвестны, но ген htp R необходим бактериям для роста при повышенной температуре, например для роста Е. coli при 42° С, и не нужен при умеренной температуре.

Независимо от продукта гена htp R тепловой шок приводит к угнетению синтеза белка в результате снижения уровня транскрипции рибосо- мальных белкой, кодируемых S 10-опероном.

Синтез БТШ может быть вызван воздействием этанола, УФ- облучением, вирусной инфекцией. Значение БТШ для клетки, видимо, очень велико. Во всяком случае, способность к синтезу БТШ обнаружена у разнообразных про- и эукариот, причем продукт гена dna К Е. coli гомологичен белку Hsp 70 Drosophila melanogaster.

Ответ па окислительный стресс исследован у Е. coli и Salmonella typhimurium. Клетки экспоненциально растущей культуры S. typhimurium, обработанные в течение 1 часа 60 мМ перекисью водорода, приобретают устойчивость к 10 мМ перекиси. Для необработанных клеток такая концентрация перекиси летальна.

Как и ответы на другие стрессорные воздействия, система ответа на окислительный стресс находится под контролем специального гена, в данном случае оху R. Клетки, имеющие устойчивость к перекиси, становятся устойчивыми и к тепловому шоку, однако тепловой шок не стимулирует устойчивости к перекисям.

Среди белков, синтез которых стимулируется в условиях окислительного стресса, видимо, имеются и ферменты, участвующие и процессах репарации ДНК, поскольку окислители вызывают ее специфические повреждения.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >