Меню
Главная
Авторизация/Регистрация
 
Главная arrow Экология arrow Экология патогенных микроорганизмов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Предметом изучения была экологическая валентность Mycobacterium bovis в почвах пастбищ .

Для индикации микобактерий туберкулеза в объектах внешней среды проводили бактериологическое исследование проб почвы с пастбищ и территорий, неблагополучных по туберкулезу крупного рогатого скота ферм. С пастбищ брали почву и траву в местах стоянок и пастьбы животных. Верхний слой почвы пастбищ и стоянок с остатками растительности на глубину до 0,5 см удаляли и брали почвенный столб, высотой 0 - 10 см и массой 0,5 кг. Исследовали среднюю пробу из 10 - 12 проб в количестве 20 кг. Траву на пастбище брали с участка 100 х 100 м, скашивая в разных местах.

Траву скармливали морским свинкам и кроликам, а часть (50 - 80 г) помещали на дно стеклянной банки, заливали 50 мл физиологического раствора на 10 - 15 минут и тщательно встряхивали. Затем заливали двойным количеством 12 %-го раствора серной кислоты, фильтровали через двойной слой марли и центрифугировали.

Центрифугирование проводили в течение 15-20 минут с таким расчетом, чтобы время обработки материала кислотой не превышало 25 - 30 минут. Осадок ощелачивали и 2 раза отмывали физиологическим раствором и засевали на 6 - 8 пробирок со средой Гельберга и готовили мазки.

Частью проб почвы без обработки кислотой заражали морских свинок, для чего измельченную пробу почвы (100 г) смешивали с таким количеством физиологического раствора, чтобы после непродолжительного отстаивания образовался надпочвенный слой жидкости в количестве 40 - 50 мл. Пробу тщательно встряхивали 5-6 минут. Через 2-5 минут надо- садочную жидкость фильтровали через марлю и центрифугировали. Цен- грифугат растворяли в 1 мл физиологического раствора и вводили подкожно морской свинке.

Для изучения выживаемости возбудителя туберкулеза бычьего вида в почвах пастбищ были использовали 12 свежевыделенных культур бычьего вида от положительно реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота.

Использованные в опытах культуры микобактерий обладали основными свойствами, характерными для бычьего вида. В мазках из патологического материала они располагались одиночно или попарно. В коротких или длинных микобактериях ясно просматривалось по 2 темно- окрашенных зерна и более. На среде Гельберга культуры к концу 1-го месяца образовывали одиночные, белесоватые, влажные и блестящие колонии. На мясопептонном глицериновом ( 4 - 5 %) бульоне через 1,5-2 недели они образовывали тонкие, нежные, сетчатые пленки, не всегда распространявшиеся по всей поверхности. На глицериновом картофеле колонии появлялись через 15-20 дней и имели вид крошковатых бугорков, разраставшихся в бородавчатые наложения. Культуры обладали каталазной активностью, суспензирование их удавалось с трудом. В мазках из культур 1,5 - 2-месячной давности микобактерии были короткими, зернистыми, темно-красного цвета.

Морские свинки, зараженные 1 мг культуры подкожно, погибали через 21-46 дней с туберкулезными поражениями селезенки, печени, иногда легких. Кролики, зараженные внутривенно 1 мг культуры возбудителя туберкулеза, погибали в сроки от 1,5 до 3 месяцев. Животные теряли в массе. Трупы были истощенными. Туберкулезные поражения обнаруживали в легких, почках и селезенке, иногда в кишечнике. Так, штамм № 198 получен посевом материала из легкого с туберкулезными узелками теленка. Видимый рост на яичной среде обнаружен на 35-й день. Через 1,5 месяца после посева на среде образовались плотные, шероховатые, круглые, беловатые колонии. Культурой 1-й генерации в дозе по 1 мг/мл физиологического раствора были заражены 2 морские свинки подкожно и 2 кролика внутривенно. Через 3 недели все подопытные животные реагировали на внутрикожную пробу туберкулином. Морские свинки пали через 32 и 34 дня. У них были обнаружены туберкулезные узелки в селезенке и печени. Масса кроликов уменьшилась на 540 и 610 г и пали они через 83 и 86 дней. При вскрытии обнаружены туберкулезные узелки величиной до горошины в легких, почках и тонком отделе кишечника.

Из органов лабораторных животных посевом на среду Гельберга была получена исходная культура.

Бычок черно-пестрой породы в возрасте 8 месяцев и живой массой 110 кг (№ 29) был заражен внутривенно 5 мг культуры штамма № 198. При исследовании на туберкулез до заражения 3 раза, с интервалом в 30 дней, животное не реагировало на туберкулиновую пробу. Через 29 дней после внутривенного заражения культурой этого штамма бычок имел массу 87 кг, реагировал на туберкулезную пробу и был убит. При вскрытии обнаружен милиарный туберкулез легких, гиперплазия бронхиальных и средостенных лимфатических узлов. Посевом материала из крови, легких, лимфоузлов и фекалий на среде Гельберга получены культуры исходного штамма.

Для сравнения выделяемых и используемых в опытах культур мы использовали музейные штаммы птичьего вида № 780 и вида Mycobacterium bovis «Vallee», любезно предоставленные нам из лаборатории туберкулеза и паратуберкулеза ВИЭВ.

В лабораторных опытах изучали выживаемость микобактерий, бычьего вида в стерильных и нестерильных почвах 7 различных типов, при температуре 20...24°С и 37,5...38,5°С. По 4 большие бактериологические пробирки (2/3 объема) наполняли черноземом обыкновенным, черноземом луговым, солончаком луговым, солонцом глубокостолбчатым и солонцом корковым, солодью, торфом (28 пробирок). Свойства взятых в лабораторные опыты почв представлены в таблице 6. По 2 пробирки каждого типа почв стерилизовали в автоклаве при температуре 120°С в течение 1 часа. Стерильность проверена посевом. Образцы почв залили суспензией культур возбудителя туберкулеза бычьего вида в концентрации 1 мг в 1 мл стерильной дистиллированной воды так, чтобы над поверхностью полностью увлажненной почвы находилась суспензия высотой 2-3 см. По одной пробирке каждого типа стерильных и нестерильных почв (14 пробирок) поместили в термостат с температурой 37,5...38,5°С, другую часть - в темный шкаф при температуре 20...24°С. Для контроля при таких же температурных условиях использовали 2 пробирки, содержащие по 10 мг культуры в 10 мл дистиллированной воды и физиологического раствора. Пробки пробирок залили смесью парафина с воском. Во время опыта и ежемесячно проводили отсев в пробирки со средой Гельберга, обрабатывая по Гону пробы из нестерильных почв. Для посевов брали 0,25 мл надпочвенной жидкости, заменяя ее таким же количеством стерильной дистиллированной воды. Материалом из нестерильных почв засевали 4 пробирки со средой Гельберга, а из стерильных - по 2 пробирки.

В течение 2,5 месяца суспензии 6 культур в концентрации 5 мг культуры в 10 мл дистиллированной воды и физиологического раствора отдельно подвергали 28-кратному замораживанию и оттаиванию. Замораживание проводили в морозильной камере холодильника «Бирюса». Оттаивали суспензии в комнатных условиях. До 1-го замораживания и после каждого оттаивания проводили посев 0,1 - 0,2 мл суспензии из всех 12 пробирок в 2 пробирки со средой Гельберга. Контролем служили посевы культур этих же штаммов, находившихся в комнатных условиях.

Для изучения влияния хлорида натрия и сернокислого натра на микобактерии туберкулеза использовали 12 культур. Были приготовлены среды Гельберга и мясопептонный глицериновый бульон (МПГБ) с содержанием от 1 до 10 % хлорида натрия и сернокислого натра в отдельности. Культуры 1-2-й генераций пересевали на указанные среды, учитывая скорость и характер роста колоний, морфологию клеток. Контролем служил посев на обычную среду Гельберга. Смесь суспензий из культур 12 штаммов микобактерий бычьего вида наносили на узкие предметные стекла по всей длине и высушивали в термостате. Эти стекла устанавливали в МПГБ таким образом, чтобы 1/3 - 1/4 длины стекла выступала над поверхностью питательной среды, и помещали в термостат. Контролем

Физико-химические свойства почв

объекта

Почва

Глубина,

см

pH

Гумус,

%

Сумма

солей,

%

Химизм

засоле-

ния

Гранулометрический состав по Качинскому (расчет на сухую навеску)

Содержание частиц (диаметр, мм), %

>

0,25

  • 0,25-
  • 0,05
  • 0,05-
  • 0,01
  • 0,01-
  • 0,005
  • 0,005-
  • 0,001

<

0,001

Сумма

<0,01

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

1.

Чернозем

обыкновенный

0-10

7,7

6,88

0,137

сульфатносодовый

4,4

46,6

19,4

6,5

10,8

12,2

29,6

2.

Глубокостолбчатый

солонец

0-20

7,0

6,17

0,189

содово-

сульфат.

2,0

24,1

44,8

7,9

9,7

11,5

29,1

3.

Черноземнолуговая солонцевато-солончаковая почва

0-7

7,9

9,87

0,178

сульфатносодовый

1,4

13,4

17,6

9,8

15,2

22,6

47,6

4.

Луговой корковый солонец

0-7

8,5

3,0

0,496

сульфатносодовый

17,5

20,9

26,6

7,7

1 1,6

16,7

36,0

5.

Луговой солончак

0-10

9,6

3,92

1,486

содовый

11.2

26,5

23,7

9,0

12,9

22,6

44,5

6.

Солодь

0-5

5,1

54,47

0,204

сульфатносодовый

6,4

23,9

25,8

11,8

15,3

16,8

43,9

7.

Торф

3-20

5,4

43,2

0,165

не определялся

служили участки суспензии на стекле, расположенные над питательной средой.

Аналогичный опыт со средой Гельберга и МПГБ был заложен с добавлением карбоната кальция в концентрациях от 0,05 до 2 % и гидрокарбоната натрия в концентрациях от 0,5 до 10,0 мг-экв/100 г питательной среды.

Для изучения выживаемости микобактерий туберкулеза в почвенных вытяжках использовали 6 культур микобактерий туберкулеза. Вытяжки из 7 ранее названных почв готовили настаиванием 100 г почвы в 200 - 300 мл дистиллированной воды в течение 24 часов при температуре 4...8°С. Надосадочную жидкость разливали по 10 мл в бактериологические пробирки и стерилизовали при температуре 120°С 30 минут. Из смеси 6 культур микобактерий туберкулеза готовили суспензии, содержащие в 1 мл дистиллированной воды 0,1 мг культуры. Суспензии в стерильных условиях наносили на стерильные предметные стекла (по 8 стекол для каждого типа почв) и после высушивания помещали в пробирку (по 4 стекла в 2 пробирках) с вытяжкой таким образом, чтобы половина стекла выступала над поверхностью вытяжки. Одну часть пробирок помещали в термостат (температура 37,5 - 38,5°С) , другую - в темный шкаф при температуре 20 - 24°С (всего 28 пробирок). Через 2, 4, 6 и 8 месяцев извлекали по одному стеклу, окрашивали и микроскопировали, сравнивая густоту и характер расположения микобактерий туберкулеза в части мазка, находившегося в жидкости, с частью мазка над поверхностью, подсчитывая количество микобактериальных клеток в 50 полях зрения в двух частях препарата. Интенсивность роста определяли делением числа микобактериальных клеток в суспензии на их число над поверхностью жидкости.

Высушиванию подвергали 4 пробы патологического материала от крупного рогатого скота и 12 проб от кроликов. Материал органов ( 50 - 60 г), имевших туберкулезные поражения, измельчали в ступке с песком и на 6,5 - 8 часов помещали в сушильный шкаф при температуре 40 - 45°С. Высохшую и измельченную массу высыпали во флаконы и закрывали пробкой.

В 30,0 г средней пробы стерильной почвы (глубокостолбчатого солонца, чернозема обыкновенного, черноземно-луговой солонцеватосолончаковой почвы и лугового коркового солонца) с горизонтов 0-30 см внесли 20,0 мл водной суспензии культур 6 штаммов микобактерий бычьего вида в концентрации 0,1 мг культуры на 1,0 мл воды. Образцы были высушены до суховоздушного состояния и помещены в стеклянные колбы с плотной пробкой. Исследованием методом посева на среду Гельберга до и после высушивания установлено наличие в указанных пробах жизнеспособных микобактерий туберкулеза. Высушенный материал хранили в комнатных условиях в течение 4 месяцев и ежемесячно проводили посевы на среду Гельберга, а заражение морских свинок осуществлялось через 1 и 4 месяца.

Опыты в полевых условиях проводили на 3-х участках пастбищ. Три участка целинной почвы пастбищ размером 5x5 м изолировали изгородью. Тип почв и их свойства представлены в таблице 7.

На остепненном злаково-разнотравном луге объекта 1 (табл. 7) преобладала следующая растительность: тысячелистник обыкновенный

  • (Achillee mellifolium), полынь широколистная (Artemisi jatifolia), солонеч- ник двухцветный (Calatella biflora), вероника колосистая (Veronica apicata), осока ранняя (Сагех ргаесох), мятник узколистный (Роа angeatitolia), горошек мышиный (Vicia сгасса), тонконог изящный (Kocleria gracilia). На территории объекта 2, находящемся на солончаковом бескилькицевом луге, произрастали: горькуша толстолистная
  • (Saussurea salsa), бескильница (Puccinellia), полынь селитряная (Artemisi nitrosa). На объекте 3, который был расположен на влажном злаковоразнотравном луге, находились, в основном: вейник незамечаемый (Calamagrostis neglect), светлуха (Scolochloa festucacea), лисохвост солончаковый (Alopecurus ventricoa), мятлик болотный (Роа polustris).

На этих грех объектах проведено несколько опытов. В опытах использованы кровь, фекалии, кусочки легких и труп теленка № 29, зараженного культурой штамма № 198, и суспензии 6 культур микобактерий бычьего вида. Наличие в перечисленном материале от бычка № 29 вирулентных микобактерий туберкулеза подтверждено бактериологическими его исследованиями.

Обсеменение опытных объектов с различными почвами проведено трижды в разные сроки (20 октября первого года, 21 октября второго года и 15 мая третьего года) наблюдения.

20 октября 0,5 м2 объекта 1 залили 4 л крови теленка № 29. На такую же площадь этого объекта поместили 10 кг фекалий, смешанных с 10 л воды. На глубину 5, 10, 20 и 40 см трех объектов в разных местах поместили по 30 - 50 г кусочков легких, селезенки, печени теленка (всего 28 тест-объектов).

Остатки трупа захоронены в почву на глубину 20 - 50 см. 21 октября участки почв размером по 20 х 20 см всех трех объектов заражены суспензиями культур возбудителя туберкулеза в дозе по 50 мг культуры в 200 мл дистиллированной воды. Такая же площадь на всех трех объектах заражена суспензией культур 15 мая в дозе по 200 мг культуры в 1000 мл дистиллированной воды.

Каждый зараженный участок почвы этикирован деревянным столбиком с надписью. Доступ животных к ним исключен. Отбор проб с участков, орошенных кровью и суспензией из фекалий теленка № 29, провели

Физико-химические свойства почв, использованных в полевых опытах

объ-

Наименование

Глубина,

см

рн

Гумус,

Сумма солей,

Химизм

засоления

Гранулометрический состав по Качинскому ( расчет на сухую навеску)

екта

почв

%

%

Содержание частиц в % (диаметр, мм)

>

0,25

  • 0,25-
  • 0,15
  • 0,05-
  • 0,01
  • 0,01-
  • 0,005
  • 0,005-
  • 0,001

<

0,001

Сумма

<

0,01

1.

Г лубокостолб- чатый солонец

0-16

6,8

7,36

0,132

сульфатно-содовый

1.7

42,6

34,6

19,0

7,9

3,2

21,1

2.

Корковый

солонец

0-6

9,5

3,58

0,766

содовый

1,2

22,7

34,8

14,9

17,6

8,8

41,3

3.

Высокостолбчатый солонец

0-9

6,2

16,34

0,134

содово-

сульфатный

1,8

38.8

32,6

10,8

1 1,2

4.8

26,8

через 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 19, 20, 21, 22 и 23 месяца. Почву с участка, политого кровью, брали с глубины от 0 до 2 и от 2 до 10 см, а с участка, инфицированного фекалиями, - с глубины от 0 до 10 см. 27 мая трава, выросшая на участке, политом кровью, скошена и скормлена морской свинке. Отбор кусочков легких и материала от трупа проводили через 7, 8, 10 и 12 месяцев.

С участков, обсемененных суспензиями культур 21 октября, через 7, 8, 9, 10, 11 и 12 месяцев взяты пробы почвы с глубины 0-10 см. С участков, зараженных 15 мая, пробы почвы с глубины от 0 до 2 см и от 2 до 10 см взяты через 1, 2, 3 и 4 месяца. Пробами почв заражали морских свинок, готовили мазки и делали посевы на среду Гельберга. От всех зараженных пробами почв морских свинок материал из паренхиматозных органов высевали на среду Гельберга. Критерием жизнеспособности микобактерий туберкулеза мы считали рост их на среде Гельберга, в том числе при посеве материала из органов зараженных морских свинок.

В период проведения опытов в весенне-осеннее время ежемесячно определяли максимальную температуру почвы на глубине 10 см. Температура воздуха, количество осадков и количество ясных, пасмурных и переменных дней учитывались по данным Чановской метеорологической станции. При закладке опытов и отборе проб с опытных участков мы определяли pH и влажность почвы, вели подсчет микроорганизмов. Для этого пробу почвы хорошо перемешивали, затем брали навеску 5 г, заливали дистиллированной водой в соотношении 1:10 и после отстаивания определяли pH вытяжки. Для определения влажности почвы из пробы в фарфоровые стаканчики (предварительно взвешенные) брали по 5 г (не менее трех навесок с каждой пробы). Стаканчики с почвой помещали в сушильный шкаф и выдерживали при температуре 105°С в течение 5 часов, затем их переносили в эксикатор, после чего взвешивали. Разница в весе, выраженная в процентах, служила показателем влажности почвы.

Подсчет почвенных микроорганизмов проводили методом посева на среду Чапека, мясопептонный агар и крахмально-аммиачный агар. Из общей смешанной пробы брали в стеклянный стаканчик 5 г почвы, заливали 0,5 % водным раствором хлористого натра и встряхивали 5-6 минут. Затем готовили три последовательных разведения в 0,5 % водном растворе хлористого натра (1:100,1:1000 и 1:10000). На среду Чапека, подкисленную молочной кислотой перед посевом, делали глубинный посев из второго (1:100) разведения, наслаивая среду на 1 мл жидкости. На мясопептонный и крахмально-аммиачный агары посевы делали из третьего и четвертого разведений, распределяя 0,1 мл жидкости по поверхности среды в

чашке Петри. Засеянные среды выдерживали при температуре 22-24°С, наблюдая за ростом в течение 10 дней. Количество микробов в 1 г сухой почвы определяли по формуле: N = (АхВхК): С , где А - степень разведения; В - средний показатель числа микроорганизмов; С - количество мл почвенной суспензии, засеваемой на одну чашку; К - коэффициент для пересчета на сухую почву. Подсчет количества грибов мы вели на среде Чапека, бактерий - на мясопептонном агаре, на крахмально-аммиачном агаре - бактерий и актиномицетов. Общими чертами актиномицетов мы считали хорошо заметное распределение и дифференцировку мицелия; часть его проникает в субстрат, часть разрастается на поверхности среды, образуя хорошо заметную простым глазом колонию. На поверхности колонии развивается воздушный мицелий в виде пушистого, бархатистого или мучнистого налета.

 
Посмотреть оригинал
Если Вы заметили ошибку в тексте выделите слово и нажмите Shift + Enter
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >
 

Популярные страницы