СПЕКТРЫ ИЗЛУЧЕНИЯ И ВОЗБУЖДЕНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ, МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫЙ ПЕРЕНОС ЭНЕРГИИ (FRET), НИЗКОТЕМПЕРАТУРНАЯ И ПРОИЗВОДНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ, ФОТОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ

ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕКТРОВ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ В ВИДИМОЙ ОБЛАСТИ

Люминесценция относится к широкому классу явлений, связанных с высвечиванием квантов света. Свечение, возникающее под действием света, возбуждающего молекулы, носит название фотолюминесценции. Если излучение происходит при переходе молекул из синглетного возбужденного состояния в основное, то такое излучение называется флуоресценцией (переход S —>Sq ). По времени затухания флуоресценции определяется время жизни возбужденного

состояния S,* (10”8— 10"9 с).

Другой тип фотолюминесценции связан с излучательным переходом из возбужденного триплетного состояния Т в исходное синг- летное состояние T-^Sq. Поскольку при этом происходит изменение спина электрона, переход запрещен квантовомеханическими правилами. Он в 105— 106 слабее, чем флуоресценция S* —hSo- Малая вероятность перехода проявляется в том, что время жизни триплетного состояния Tj (длительность фосфоресценции) составляет 1 O’4-10’'с, что на несколько порядков больше, чем длительность флуоресценции.

Широкое использование метода исследования спектров флуоресценции обусловлено рядом его важных преимуществ, к числу которых относится высокая чувствительность в сочетании с возможностью прижизненного изучения сложных биологических объектов без повреждения их структуры и функции. Спектрофлуориметрия позволяет осуществить качественный и количественный анализ флуоресцирующих веществ, а оценки параметров свечения дают подробную характеристику состояния биологически важных молекул в сложной системе, особенностей их микроокружения.

Чувствительность флуоресценции к незначительным изменениям агрегации молекул, комплексообразованию, изменению окислительно-восстановительного равновесия, конформационным перестройкам, изменениям pH, полярности среды, а также применение флуоресцентных зондов и т.д., делает люминесцентный анализ эффективным методом исследования состояния и функционирования молекулярных и надмолекулярных структур. Особенно перспективно сочетание спектроскопии и микроскопии с использованием лазерной техники и счетчиков квантов.

Процессы, происходящие в молекуле после поглощения света, можно изобразить схемой, приведенной на рис.4. 1.

схема электронных уровней органической молекулы и переходов между ними

Рис.4.1.Принципиальная схема электронных уровней органической молекулы и переходов между ними.

S0 - основной уровень, S* и S2 - первый и второй синглетные возбужденные уровни, Ть Т2 - первый и второй триплетные уровни. Интервалы между колебательными уровнями (тонкие горизонтальные линии) для простоты представлены одинаковыми. А -акцептор энергии, kt - константа переноса (миграции) энергии.

При комнатной и более низкой температуре акт поглощения начинается с одного из более низких колебательных подуровней нижнего невозбужденного состояния So. (В темноте энергия преобладающей части молекул соответствует этому подуровню). После акта поглощения (переход So —? Sn ) в начале происходит быстрая (10’2 - 10‘13 с) растрата части энергии в тепло. Молекула оказывается на одном из самых нижних колебательных подуровней верхнего электронновозбужденного состояния Si*,время жизни которого 10’8 -10’9 секунды. Излучение энергии, избыточной над равновесной (флуоресценция), происходит с этого уровня на один из колебательных подуровней нижнего невозбужденного состояния So, после чего, быстро растрачивая избыток колебательной энергии в тепло, молекула оказывается на исходном нижнем колебательном подуровне основного состояния So. Кроме излучения кванта с уровня Si энергия может расходоваться в тепло (константа kj), на фотохимическую реакцию (константа к,), на реакцию с тушителем флуоресценции (константа kq), или перенос энергии (к). Кроме того, молекула может перейти в триплетное возбужденное состояние Т (kst) с последующим излучением фосфоресценции (кри).

Время жизни возбужденного состояния г есть величина, обратная константе скорости растраты энергии:

Если существует только один путь растраты энергии - излучение флуоресценции, то соответствующее время жизни г о называется радиационным (излучательным) или естественным временем жизни:

Его можно определить по отношению площадей (интегралов) полос флуоресценции и поглощения. Если же существуют и другие пути растраты энергии, то время жизни возбужденного состояния называют действительным временем жизни:

Константы скоростей параллельно идущих процессов складываются.

Квантовый выход отдельного процесса растраты энергии возбужденного состояния равен отношению константы скорости этого процесса к сумме констант всех процессов. Так, квантовый выход флуоресценции (cpj) равен:

Сопоставляя приведенные формулы, получим важное соотношение для определения действительного времени жизни:

Используя измеренную величину квантового выхода (см. ниже), можно найти значение действительного времени жизни г.

Основные экспериментально проявляющиеся закономерности люминесценции (флуоресценции и фосфоресценции), соответствующие приведенной схеме, сводятся к следующему.

  • 1) Активными в люминесценции (а также и фотохимии, миграции энергии) являются самые нижние из электронно-возбужденных состояний, а именно .S) и Т состояния. (Излишек энергии более высоких возбужденных состояний быстро растрачивается в тепло).
  • 2) Квантовый выход флуоресценции не зависит от величины поглощенного кванта, следовательно, от длины волны возбуждающего света, т.к. излучательный переход осуществляется с самого нижнего электронного возбужденного уровня (Si или 7)) и, преимущественно, с нижнего колебательного подуровня этих состояний.
  • 3) По этой же причине форма спектра флуоресценции не зависит от длины волны возбуждающего света. Она определяется структурой колебательных уровней основного состояния So.
  • 4) Спектр флуоресценции смещен в длинноволновую сторону по отношению к самой длинноволновой полосе спектра поглощения (правило Стокса), рис.2. Это обуславливается тем, что часть энергии поглощенного кванта растрачивается в тепло как в нижнем, так и верхнем электронно-возбужденном состоянии.
  • 5) Из условия одинакового расположения колебательных подуровней в возбужденном и невозбужденном состоянии следует, что форма спектра флуоресценции должна быть зеркально симметричной по отношению к длинноволновой полосе спектра поглощения (осью симметрии служит частота 0-01 перехода).
 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >