Меню
Главная
Авторизация/Регистрация
 
Главная arrow География arrow Биоиндикация загрязнений

Методы биомаркеров

Термин «биологический маркер» («биомаркер») введен Национальной академией паук США в 1989 г. для биологического мониторинга населения. В широком смысле он охватывает различные показатели, характеризующие взаимодействие между биологической системой и потенциально опасным для нее агентом, который может иметь физическую, химическую или биологическую природу. В 2001 г. рабочая группа Национальных институтов здоровья (США) стандартизировала определение биомаркера как «характеристики, которая объективно измеряет и оценивает в качестве индикатора нормальные биологические процессы, патогенные процессы или фармакологические ответы па терапевтическое вмешательство», и определила типы биомаркеров.

В экологические исследования термин пришел из медицины, где под словом «биомаркер» обычно понимают некоторую измеримую характеристику, которая отражает наличие, отсутствие или тяжесть заболевания. В более общем виде биомаркером является любой индикатор определенного заболевания или другого физиологического состояния организма. Однако, как указывается в ряде исследований, во многих случаях неясно, отражают ли биомаркеры соответствующее воздействие па организм, процессы, связанные с данным воздействием, индивидуальную чувствительность или раннюю стадию болезни. А это затрудняет составление заключения о причинах заболевания.

Биомаркеры, так же как и биоиндикаторы в целом, могут быть специфическими и неспецифическими. Специфические биомаркеры указывают на биологический эффект конкретного воздействия. Неспецифические маркеры отражают общий, комплексный эффект комбинированного воздействия, а не конкретную причину эффекта. Кроме того, они могут быть связаны как с наличием различных поллютантов, так и с природными факторами.

Применение биомаркеров при оценке качества среды имеет несколько аспектов. С помощью биомаркеров можно, во-первых, показать, что организм подвергается воздействию биологически доступных веществ, а во-вторых —выявить негативные эффекты, вызываемые веществом в организме. Кроме того, оценивая тот или иной биологический ответ, можно установить степень загрязнения окружающей среды.

В настоящее время говоря об использовании биомаркеров для оценки состояния окружающей среды, имеют в виду прежде всего различные биохимические и физиологические параметры организмов, хотя в некоторых случаях речь может идти также и об анатомических и морфологических изменениях особей. Перечислим наиболее распространенные биомаркеры, применяемые для оценки загрязнения окружающей среды.

1. Содержание этоксирезоруфин-О-диэтилазы. Метод определения этого вещества (Ethoxyresorufin-o-deethylase (EROD)) рекомендован для оценки качества воды и включен в перечень международных стандартов «Качество воды. Биохимические и физиологические измерения, проводимые па рыбе. Часть 2. Обозначение: ISO/TS 23893-2:2007. Код МКС: 13.060.70 Разработчик: ISO ТС 147/SC 5. Биологические методы. Кол-во стр: 24. Дата введения в действие 15.11.2007».

2. Концентрация ПАУ в желчном пузыре. Присутствие ПАУ в среде можно быстро выявить, анализируя состав желчи рыб. Этот метод широко применяется при экологическом мониторинге воздействия нефтегазодобычи па морские экосистемы. На рисунке 23 представлено изменение состава желчи и накопление веществ группы ПАУ после аварийного разлива нефти на акватории.

Рис. 23. Накопление веществ группы ПАУ в желчном пузыре рыбы после аварийного разлива нефти (по материалам S. Sanny, R. Sundt, J. Beyer, 2007)

3. Повреждение ДНК (DNA damage). Для количественной оценки генетических эффектов поллютантов используют частоты различных хромосомных аббера- ций (разломов, изменения строения хромосом) и частоты обмена участками у сестринских хромосом. Последний критерий применяется в отношении полихет, моллюсков и рыб.

У рыб и млекопитающих в качестве биомаркера широко используется доля клеток с микроядрышками в эритроцитах периферической крови. Формирование этих структур обусловлено разломами хромосом, происходящими вследствие нарушения процесса деления клеток. Микроядрышки представляют собой крошечные скопления хроматина, разбросанные в цитоплазме. Значительное повышение частоты таких разломов по сравнению с уровнем естественного мутагенеза было установлено при воздействии бенз(а)пирена, этилметансульфопата и др.

В настоящее время в исследованиях in vivo и in vitro широко используется и становится неотъемлемой частью программ по биомониторингу также метод ДНК- комет. Метод получил такое название, поскольку после специальной обработки биоматериала релаксироваппые петли и фрагменты ДНК вытягиваются в электрическом поле по направлению к аноду, что и придает наблюдаемым объектам вид «комет». Применение метода позволяет учитывать гетерогенность сложных популяций, изучать выход повреждений ДНК и репарацию практически в любых эукариотических клетках (от бактерий до человека). При визуальном анализе ДНК-кометы ранжируют па пять условных типов с соответствующим числовым значением от О до 4. Индекс ДНК-комет (index of DNA comet) рассчитывается по формуле

где по, п, П2, пз, П/4 — числа ДНК-комет каждого типа, а ^ — сумма подсчитанных ДНК-комет.

4. Концентрация генов вителлогенина животных и рыб. Размножение представляет собой весьма сложный процесс, в регуляцию которого вовлечены очень многие гормоны, специализированные белки, а также внешние сигналы. Например, у позвоночных животных яйцеклетки в процессе созревания проходят две основные фазы: первичный рост и вителлогенез. На стадии первичного роста происходят увеличение объема ооцитов и развитие специализированных внутриклеточных структур и оргапелл. Вителлогенез сводится к выработке особого белка — вителло- генина и его загрузке в желток. Вителлогепин продуцируется в печени и поступает в кровь в ответ на изменение содержания одного из гормонов размножения — эстрадиола. Сложность механизма размножения обусловливает уязвимость репродуктивной системы, поскольку нарушение хода всего этого процесса может произойти практически на любой из его стадий. Одно из наиболее обычных негативных последствий— отсутствие овуляции, или атрезия. Атрезию могут вызывать стрессы различного происхождения, изменения фотопериода, температурного режима, недостаточное качество пищи, а также различные поллютанты, например ПХБ, ПАУ, ряд пестицидов. Сбой процесса размножения можно выявить и по концентрациям тех или иных гормонов, регулирующих этот процесс (например, эстрадиола). В качестве биоиндикаторов могут быть использованы также эффективность оплодотворения, эффективность вылупливания потомства из яиц, состояние самих яиц и т. и.

5. Содержание ферментов группы цитохромов Р450 (гемтиолатного протеина Р450). В естественных условиях многие организмы способны преобразовывать ксенобиотики в менее токсичные вещества. Биотрапсформация ксенобиотиков является многоступенчатым процессом, в котором одновременно или поочередно участвуют многие ферменты детоксикации. Она включает в себя три фазы: I — активацию, II — детоксикацию, III — выведение (Гинтер, 2003; Александрова др., 2011 и др.). Основными ферментами I фазы являются цитохромы Р450, эпоксидгидролазы, и флавин-монооксигеназы. Ко II фазе относятся гены семейства трансфераз: глюта- THOii-S-трапсферазы (GST), N-ацетил-трапсферазы (NAT), UDF-глюкорои-сульфо- трапсферазы (UGT). Наиболее важными среди них являются микросомальные мо- пооксигепазы (МОГ). Активным агентом этих ферментов служит цитохром Р450. Ббльшая часть этих ферментов сосредоточена в печени, хотя активность данных ферментов проявляется и в других органах и тканях. В частности, у рыб монооксигеназы наиболее активны в жабрах, печени и почках. Выработка МОГ начинается при поступлении в организм липофильных поллютантов, например ПХБ, ПХДД, ПАУ. Соответственно повышаются внутриклеточные концентрации этих ферментов.

Уровень активности мопооксигеназпого окисления сравнительно высок в тканях человека и теплокровных животных, ниже — в тканях рыб и очень низок в растениях. Можно говорить и о видовой специфичности активности монооксигепаз. Так, па- пример, активность моиоокисгеназ гепатоцитов птиц (скорость О-деалкилироваиия этоксирезоруфина) убывает в ряду: перепел > пустельга > голубь > цапля > чайка (Котелевцев и др., 2012). Скорость и характер индукции монооксигепаз также зависят от вида животных.

Вместе с тем с помощью этих же ферментов ксенобиотики обезвреживаются и выводятся из организма, что затрудняет применение их в биоиндикационных целях. Другая проблема с монооксигеназами состоит в том, что иногда они вырабатываются в ответ па изменения температуры, при стрессах, возникающих в результате помещения животного в неволю и т. д. Тем не менее считается, что при грамотном выборе контрольных участков для сравнения применение МОГ в качестве биомаркера может оказаться очень эффективным.

6. Наличие генов семейства глютатион-8-трансферазы (GST). Эти гены относятся к ферментам второй фазы детоксикации ксенобиотиков и обеспечивают трансформацию электрофильных метаболитов в водорастворимые нетоксичные соединения, которые выводятся из организма (Кукес, 2004). Глутатион-Б-трансфера- зы катализируют взаимодействие глутамата с различными алифатическими, ароматическими, эпоксидными и гетероциклическими радикалами широкого спектра соединений (Кольмаи, 2000). Глутатиоиовая антиоксидантная система эффективно защищает клетки от оксидативиого стресса.

Эффективность действия всей системы детоксикации обеспечивается слаженной работой ферментов каждой фазы. Тем самым осуществляется защита организма от повреждений, вызываемых воздействиями внешней среды. Десиихронизация их активности может быть причиной оксидативиого стресса, интоксикации или мутагенности (Кулииский, 1999; Лучинина, 2010).

7. Концентрация белков металлотионеинов (Metallothionein). Важной группой белков, связывающих ионы металлов, являются металлотионеины (МТ). Эти ферменты участвуют во многих процессах метаболизма металлов — от регуляции потребления необходимых микроэлементов до их детоксикации. МТ рассматриваются в качестве перспективных биомаркеров для выявления ионов Cd, Си, Zn и Hg. Однако концентрация МТ в клетках может повышаться не только вследствие действия поллютантов, но и в ходе полового созревания, при изменениях температуры и других факторов. Индукция синтеза МТ была хорошо изучена па примере рыб, двустворчатых моллюсков и некоторых других организмов.

8. Инактивация дегидратазы (5-аминолевулиновой кислоты (ALAD). Ведущим патогенетическим механизмом токсического воздействия некоторых загрязняющих веществ на организм является энзимопатический эффект, приводящий к инактивации ряда ключевых ферментов за счет блокады активных центров (соединение с сульфгидрильпыми (-SH-), карбонильными группами). Так, например, среди наиболее существенных проявлений энзимопатического действия свинца можно назвать вызываемые им нарушения в биосинтезе порфиринов и гема, а также изменения активности ряда эритроцитарных и печеночных ферментов. Свинец соединяется с сульфгидрильпыми, карбоксильными и аминными группами активных центров ферментов. За счет взаимодействия с сульфгидрильпыми группами и ингибирования ключевых ферментов, участвующих в синтезе гема, РЬ оказывает значительное влияние на синтез гема (Тихонов, Цыган, 2010). Одним из таких ферментов является дегидратаза <5-аминолевулииовой кислоты (ALAD) — цитозольный фермент, катализирующий образование порфобилиногена. Ингибирование ALAD приводит к накоплению 5-амииолевулиновой кислоты (ALA) и подавлению образования гема. Амииолевулииовая кислота синтезируется в митохондриях из глицина и сукцинил-КоА синтетазой аминолевулиновой кислоты (ALAS)—лимитирующим ферментом при синтезе гема. Снижение активности ALAD и активация ALAS приводит к повышению содержания аминолевулиновой кислоты в различных тканях и в плазме крови, а также к увеличению секреции ALA в мочу. В качестве биомаркера используется угнетение активности дегидратазы (5-аминолевулиновой кислоты в сыворотке крови, в мозге и т. д.

9. Ингибирование ацетилхолинэстеразы (AChEI) или анти-холинэстеразы. Активность ацетилхолинэстеразы считается хорошим биомаркером для мониторинга загрязнения окружающей среды иейротоксическими соединениями, такими как фосфорорганические инсектициды и карбаматы. Эти вещества снижают активность фермента ацетилхолинестеразы и тем самым повышают уровень нейромедиатора ацетилхолииа в организме.

10. Концентрация бенз(а)пирен гидроксилазы в моллюсках (ВаРН — mussel).

11. Оксидативный стресс (Oxidative stress, TOSC). Все формы жизни сохраняют восстановительную среду внутри своих клеток. Клеточный «редокс- статус» поддерживается специализированными ферментами в результате постоянного притока энергии. Нарушение этого статуса вызывает повышенный уровень содержания токсичных реактивных форм кислорода, таких как пероксиды и свободные радикалы, в биоматериале. В результате могут окисляться важные компоненты клетки — липиды и ДНК, — что приводит к повреждению клетки. Одним из основных способов неспецифической защиты жизнеспособности органов и тканей является активность антиоксидантных систем, обеспечивающих устойчивость живых клеток к свободнорадикальному повреждению. Среди антиоксидантов различают ферментативные (оксидоредуктазные ферменты и антиперекисные ферменты) и неферментативные (низкомолекулярные тиолы, аскорбиновая кислота, токоферол, витамины А, К, Р, убихииои и др.) звенья. В качестве показателей оксидативного стресса используются, например, ферменты глутатионовой системы (GR и GPX) и супероксидисмутаза (SOD), которые играют исключительно важную роль в нейтрализации реактивных форм кислорода при хроническом стрессе.

12. Гистопатология. Поступление ксенобиотиков в организм в большинстве случаев приводит к запуску сложной цепочки биохимических реакций, приводящих к гибели клетки. Результатом этого является дегенерация, или некроз, тканей. Некротические участки могут иметь небольшие размеры (и тогда они выглядят на препаратах как своего рода включения) либо затрагивать всю ткань в целом. Количественными показателями, отражающими степень загрязнения среды, в данном случае будут частота встречаемости некрозов у разных особей индикаторного вида и степень омертвления тканей. Обычно для гистологического анализа используют ткани печени и почек, выполняющих основную роль в детоксикации чужеродных веществ и выведении их из организма.

Важным гистологическим биомаркером является нарушение роста тканей. Выделяют два типа таких изменений: пролиферативные нарушения, охватывающие нарушения клеточной дифференциации, а также снижение или, наоборот, повышение скорости роста тканей, приводящее к гипертрофии; неоплазмы, включающие аденомы (доброкачественные опухоли) и карциномы (злокачественные опухоли).

Возможно использование патологии органов и систем органов. Например, одной из легко выявляемых патологий у рыб является плавниковая эрозия. Она выражается в отмирании эпидермальной и костной тканей. В итоге плавник либо не развивается нормально, либо полностью редуцируется. В лабораторных экспериментах было доказано, что плавниковая эрозия может вызываться ПХБ, сырой нефтью, Pb, Zn, Cd и др. Предполагается, что помимо химического загрязнения свой вклад в плавниковую эрозию вносит также вторичная микробная инфекция.

Часто в непосредственное соприкосновение с поллютантами входят наружные покровы тела. В связи с этим могут наблюдаться патологические явления в виде эрозий, опухолей и т. и. Так, у рыб, обитающих в загрязненных водоемах, нередко возникают аномалии в строении скелета. Они могут выражаться в слиянии позвонков, искривлении позвоночного столба, неправильном развитии костей головы, плавников и жаберных дуг. Экспериментально доказано, что такие нарушения могут быть вызваны воздействием некоторых хлорорганических пестицидов, а также тяжелых металлов.

13. Показатели иммунотоксичности. Иммунная система принимает непосредственное участие в распознавании и нейтрализации чужеродных соединений. Поэтому в качестве биомаркеров используются различные иммунологические показатели. Показано, что подобными биомаркерами могут служить качественный и количественный состав крови, активность макрофагов, а также концентрация специфичных антител. Иммунологические биомаркеры очень перспективны для био- индикации, однако исследования в этой области только начинаются.

14. Лизосомная стабильность. На клеточном уровне лизосомная система представляет собой особую «мишень» (с точки зрения токсических эффектов) для многих загрязняющих веществ, которые могут легко аккумулироваться лизосомами. Изменения лизосомиых систем прямо указывают па патологию и могут применяться для определения загрязнения окружающей среды. Обычно такие исследования проводятся на тканях моллюсков (чаще всего Mytilus edulus; рис. 24) и печени рыб, богатых лизосомами (Moore et al., 1986). На основе изменения лизосомной стабильности организмов из различных водоемов дана оценка качества среды обитания акваторий Исландии (L. Da Ros et al., 2007).

15. Возможность для роста (Scope for growth, SFG). Эффекты стресса. Как известно, часть энергии, которая не затрачивается организмом на поддержание нормального функционирования, расходуется на процессы роста. Однако в случае если организм подвергается стрессу, включая воздействие чужеродных ве-

Рис. 24? Изменение лизосомной стабильности мидии Mytilus edulus под действием токсикантов: а — неизмененные клетки; б — погибшие клетки

ществ, излишки энергии идут на его компенсацию. В результате скорость роста организма замедляется. Для изучения воздействия поллютантов на рост животных или растения обычно экспонируют вблизи источника загрязнения. В ходе экспозиции периодически производят необходимые промеры, по которым судят о скорости линейного роста. Например, ювенильных моллюсков помещают в специальные садки, конструкция которых позволяет животным нормально питаться и обеспечивает доступ кислорода к ним.

В целом при использовании биомаркеров необходимо иметь в виду, что биохимические и физиологические процессы могут изменяться в ответ не только па загрязнение, по и па природные факторы (физико-географические условия местообитания, время года, репродуктивный статус и т. и.). Поэтому очень важно на контрольных участках отбирать организмы для исследований строго в то же самое время и с использованием тех же методов отбора. Влияние природных факторов (освещенность, режим увлажнения и др.) можно выявить только при учете таких параметров, как возраст, репродуктивный статус и пол отловленных организмов.

 
Посмотреть оригинал
Если Вы заметили ошибку в тексте выделите слово и нажмите Shift + Enter
     
    Популярные страницы