Содержание пигментов

Содержание фотосинтезирующих пигментов — хлорофиллов а, Ь, с и каротиноидов (каротина и ксантофилла) определяется с помощью спектрофотометрического метода (Пыри- на, Елизарова, 1971). Полные сводки рекомендаций по определению хлорофилла в водорослях содержатся в ряде руководств (Strickland, Parsons, 1969).

Ниже приведено описание основных приемов определения хлорофилла в пробах природного фитопланктона и культур водорослей.

Пробу воды, объем которой соответствует содержанию в ней хлорофилла а от 1 до 20 мкг/л, фильтруют через мембранные фильтры диаметром от 30 до 60 мм (размер пор около 0,65 мкм). Для концентрирования фитопланктона в природных водах используют несколько литров воды (морской — до 10 л и более), для концентрирования культур — в пределах 5—10 мл. Перед фильтрованием для предотвращения разрушения пигментов фильтр покрывают слоем порошка углекислого магния (или сернокислого бария) и растертого стекла из расчета 10 мг/см2 фильтрующей поверхности. Чтобы уменьшить возможность разрушения фитопланктона фильтрацию следует проводить при небольшом разрежении, — в пределах 2/3 атм. Для фильтрации следует использовать воронки из плексигласа. После окончания фильтрации рекомендуется сразу провести экстрагирование содержимого фильтра без его подсушивания, чтобы свести к минимуму потери от разрушения пигментов. Хранение высушенных фильтров допускается от нескольких дней до двух месяцев в присутствии селикагеля в темноте при температуре не выше 1 °С. Однако необходимо иметь в виду, что потери пигментов при этом могут достигать 10-15%.

В качестве растворителя используется 90-процентный водный раствор ацетона или этиловый спирт (96%). Экстракция пигментов ацетоном для некоторых водорослей менее эффективна, чем экстракция этиловым спиртом. Однако спектральные характеристики пигментов в ацетоне изучены значительно лучше, поэтому можно использовать любой из этих растворителей.

При экстракции ацетоном фильтр заливают 2—3 мл 90-процент- ного ацетона и растирают в гомогенизаторе в течение 1 мин. Полученную смесь переносят в центрифужную пробирку, добавляют 90-процентного ацетона до объема 5—10 мл и выдерживают в темноте при комнатной температуре в течение 10 мин. Центрифугирование экстракта проводят в течение 10 мин при 4000—5000 об/мин. Затем прозрачный супернатант переносят в кювету спектрофотометра толщиной 1 см.

При экстракции этиловым спиртом после гомогенизации материала проделывают те же процедуры. Смесь доводят до объема 5—10 мл кипящим раствором метанола, после чего экстракт сразу же центрифугируют (в тех же условиях) и супернатант переносят в кювету спектрофотометра толщиной 1 см.

Клетки сценедесмуса плохо растираются, поэтому экстракция ацетоном малоэффективна. В таком случае 5—10 мл суспензии водорослей фильтруют через мембранный фильтр с порами диаметром 1,5 мкм. Затем фильтр с клетками водорослей помещают в градуированную пробирку, заливают 4—5 мл этилового спирта, плотно закрывают пробкой и ставят в холодильник на 1—3 сут для экстракции пигментов.

Оптическую плотность полученного экстракта определяют на спектрофотометре в кварцевых кюветах для зеленых водорослей при длинах волн 663, 645 и 630 нм, что соответствует максимуму поглощения света хлорофиллами а, b и с, а также 430 и 750 нм, что соответствует максимуму поглощения каротиноидов. Последний максимум поглощения определяют для введения поправки на неспецифическое поглощение и рассеяние света экстрактом. Его величину отнимают от экстинкций соответствующих пигментов.

Для расчета содержания хлорофилла а предлагается использовать следующие простые соотношения между его концентрацией в мкг/мл растворителя и оптической плотностью Е, измеренной при 665 нм в кювете толщиной 1 см:

  • • для ацетонового экстракта: Chi а = 11,9 Е665;
  • • для спиртового экстракта: Chi а = 13,9 Евв5

Если возникает потребность в более точном определении содержания хлорофилла, измерения проводят при трех длинах волн и рассчитывают содержание хлорофилла а, b и с, используя следующие уравнения для ацетонового раствора (в плане унификации расчетных формул лучше применять формулы, рекомендованные рабочей группой № 17 при ЮНЕСКО):

• для хлорофилла а:

для хлорофилла b:

• для хлорофилла с:

где Са, Сь, Сс концентрация (мг/л) хлорофилла а, b и с, соответственно, в экстракте; Еш Ев45 Ет измеренная оптическая плотность (в кювете толщиной 1 см) при соответствующих длинах волн.

Использованные коэффициенты экстракции: для хлорофилла а — 89,31 л/г • см при 663 нм, для хлорофилла b — 52,14 л/г • см при 645 нм, для хлорофилла с — 19,44 л/г • см при 630 нм. Расчет содержания пигментов проводят по формулам и выражают либо в мг/л, либо в % к количеству сухого вещества, либо пересчитывают на 1 млн клеток.

По данным о концентрации хлорофилла а можно рассчитать величину биомассы фитопланктона. Хлорофилл а составляет примерно 2,5% от количества сухого вещества, т.е. 3,4% от обеззоленной сухой биомассы или 6,75% от содержания органического углерода (Винберг, 1960). Таким образом, при переходе от концентрации хлорофилла а к биомассе, выраженной в единицах углерода, допустимо использовать пересчетный коэффициент 15, т.е., В= 15 СЫ а.

При определении биомассы и продукции водорослей хлорофиль- ным методом большое значение имеет степень извлечения (экстракция) пигментов из клеток водорослей. Многие из них имеют плотные оболочки, которые с трудом поддаются разрушению.

Ввиду небольших размеров клеток и наличия у многих из них плотной оболочки (например, у сине-зеленых, некоторых протококковых водорослей), предварительное разрушение клеток требует применения ряда специальных приемов. С этой целью используют механическое разрушение клеток с наполнителем (кварцевым песком, стеклянным порошком и др.), ультразвуковые дезинтеграторы, некоторые ферменты (например лизоцим, мурамидазу) и др.

Ниже приведено несколько методик разрушения клеток водорослей и экстракции пигментов.

Хорошие результаты дает применение порошка из синтетических алмазов (ACM 40/28) с размерами зерен основной фракции 28—40 мкм. Его зернистость соизмерима с величиной клеток водорослей, не засоряет поры стеклянных фильтров Шотта, которые используются для разделения взвеси и хлорофилла. Использованный алмазный порошок поддается регенерации (после озоления органического вещества и последующего промывания).

Навеску водорослей переносят в фарфоровую ступку, добавляют 50—100 мг алмазного порошка (при анализе пигментов достаточно взять порошка в однократном отношении к весу навески), немного мела, несколько капель растворителя (ацетона, метанола). Процесс растирания занимает в среднем в 3 раза меньше времени, по сравнению со стеклянным порошком. Особенно удобны алмазные порошки для работ, когда требуется быстрое и максимально полное разрушение клеток и экстрагирование пигментов без использования дополнительных факторов (нагрева, замораживания и др.).

Экстракция пигментов из водорослей, имеющих слизистый слой, крайне затруднена — слизь не позволяет растворителю проникать в клетку. Для лучшей экстракции необходимо разрушить оболочку. Это достигается различными приемами.

Клетки, отцентрифугированные от среды при 1000 об/мин в течение 5 мин, суспензируют в небольшом количестве метанола или ацетона. Полученную суспензию растирают в фарфоровой ступке со стеклянным порошком или другими веществами (тальком, абразивом, алюмогелью, безводным сернокислым натрием). Порошковидное вещество берут в 10-кратном по объему количестве по отношению к объему суспензии. Часто используют безводный сернокислый натрий, который обезвоживает ткани, сохраняя пигменты.

Водоросли растирают в течение 3—6 мин до полного испарения метанола. Полученный порошок наносят на стеклянный фильтр (№ 3 или № 4) и заливают небольшой порцией растворителя. После 3—4-кратной экстракции порошок с водорослями становится совершенно бесцветным.

Полнота экстракции пигмента зависит не только от степени разрушения клеточной оболочки, но и от характера растворителя. Наиболее часто применяют полярные растворители — ацетон и этанол. Каротин из растительных клеток извлекают гексаном, петролейным эфиром или бензином.

Для извлечения пигментов из высушенного материала необходимо предварительно экстрагировать его 45—50-процентным ацетоном. Такой раствор ацетона удаляет большое количество водорастворимых примесей, что облегчает дальнейшее извлечение пигментов чистым ацетоном.

Извлечение пигментов зеленых нитчатых водорослей (обрастате- лей). Из предварительно измельченной на стекле биомассы водорослей берут навеску 0,5—1 г, помещают ее в фарфоровую ступку, добавляют 0,5-1 г абразива или стеклянного порошка, 10-15 г мела или соды, несколько капель растворителя и растирают в течение 5—10 мин. К растертой массе добавляют 2—3 мл растворителя и отфильтровывают через стеклянный фильтр Шотта № 4 с помощью колбы Бунзена и вакуумного насоса. К оставшейся массе снова добавляют 2—3 мл растворителя и экстракт сливают на фильтр. Экстракцию повторяют 3—5 раз, пока в приемную посуду не начнут стекать бесцветные капли фильтрата. Объем вытяжки пигментов доводят до 10-20 мл. В полученном экстракте определяют либо суммарное количество пигментов, либо содержание каждого пигмента отдельно.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >