Вторичный (IgG) ответ in vivo

Первичную иммунизацию в объеме 0,5 мл проводят внутривенно 2%-й суспензией клеток ЭБ. Через 30 сут после первичной иммунизации внутривенно проводят вторичную иммунизацию суспензией ЭБ в дозе 10 • 106/мышь. Количество IgG-АОК определяют в селезенке на пике иммунного ответа (на 5-е сут после вторичной иммунизации) методом локального гемолиза. Клетки селезенки инкубируются 2 ч при температуре 39 °С в камерах с ЭБ, комплементом морской свинки и кроличьей антисывороткой против мышиного IgG (разведение — 2000 раз). Зоны гемолиза подсчитываются под увеличением х42. Результаты выражают в абсолютном количестве IgG-АОК в селезенке.

Продукция иммуноглобулина IgG В-клетками in vitro

Продукцию иммуноглобулина IgG клетками селезенки и костного мозга, спонтанную и ЛПС-стимулированную, определяют в супернатантах клеточных культур после культивирования в течение 7 сут. Оптимальная доза Л ПС Е. coli в предварительных опытах составляет

из

30 мкг/мл. Результаты выражают в мкг/мл и индексах стимуляции (ИС — отношение разницы между опытом и контролем к контролю).

Концентрацию иммуноглобулина IgG в периферической крови и супернатантах культур определяют твердофазным вариантом метода иммуноферментного анализа в 96-луночных плоскодонных планшетах с помощью меченного пероксидазой хрена конъюгата и ОФД в качестве субстрата. В качестве основного буфера используется трис-НС1, а блокирующего агента — желатин. Перед определением концентрации Ig предварительно устанавливают оптимальные разведения конъюгатов и антисывороток. Интенсивность реакции оценивают на многоканальном спектрофотометре, например Multiskan, при X = 492 нм. Калибровочную кривую строят по препаратам IgG (Sigma) (10—100 нг/мл). Результаты выражают в абсолютных значениях (мг/мл, мкг/мл).

Наличие иммуноглобулинов определенного класса важно исследовать и в других случаях. Их количество устанавливают с помощью методов радиальной иммунодиффузии. Метод радиальной иммунодиффузии основан на прямой зависимости диаметра кольца преципитата, который образуют иммуноглобулин пробы с антисывороткой, смешанной с гелем.

При определении титра секреторных антител к бактериям используют реакцию агглютинации со слизью. Уровень секреторных антител не совпадает с содержанием сывороточных антител и в десятки раз превышает последние.

Реже обнаруживают антителопродуцирующие клетки. Их индицируют при помощи меченых антител или антигенов. В первом случае наиболее популярным является сэндвич-тест (от англ, sandwich — многослойный) , смысл которого сводится к последовательному нанесению на мазок-отпечаток или срез лимфоидной ткани сначала взвеси или раствора соответствующего антигена, а затем гомологичной им меченной флуорохромом антисыворотки. Светящийся антиген локализуется на клетках, продуцирующих антитела, высвечивая их контуры.

Если нужно обнаружить не антитело, а иммуноглобулинпродуци- рующие клетки, то используют прямой и непрямой варианты МФА с применением меченой антивидовой сыворотки ко всем глобулинам или к иммуноглобулинам определенного класса. Антитела можно также тестировать in vitro в реакциях торможения агглютинации, преципитации, лизиса, конглютинации, иммунного прилипания, опсо- низации, a in vivo — в реакции защиты.

Гиперчувствительность туберкулинового типа (ТУТ) тестируют на животных и лабораторными методами. При определении ГТТ животным, предположительно сенсибилизированным, вводят внутрикожно (предпочтительно), подкожно, наносят на скарифицированную кожу или на слизистую оболочку глаз аллерген. В положительном случае 114

через 12—48 ч на месте аппликации последнего развивается продуктивное воспаление, по степени выраженности которого судят о контакте организма с микробом, гомологичным применному аллергену. Таким образом диагностируют туберкулез, паратуберкулезный энтерит рогатого скота, сап, мелоидоз, псевдотуберкулез, туляремию, листериоз, бруцеллез, сальмонеллез и др.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >