Меню
Главная
Авторизация/Регистрация
 
Главная arrow Агропромышленность arrow Ветеринарная иммунология (теория и практика)

Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ)

Существуют вещества растительного и бактериального происхождения, которые оказывают на лимфоциты млекопитающих митогенное действие. Для оценки функционального состояния Т-лимфоцитов используют фитогемагглютинин (ФГА) и конканавалин А (Кон А) — лектины растительного происхождения, а для оценки функционального состояния В-клеток (в присутствии Т-лимфоцитов) — митоген лаконоса (МЛ). Мононуклеары периферической крови инкубируют в присутствии вышеуказанных митогенов в течение 72 ч. Результаты реакции оценивают по включению Н3-меченого тимидина.

Постановка метода реакции бласттранформации с клетками селезенки мышей не имеет принципиальных отличий от постановки метода при использовании клеток крови животных. Селезенки мышей забирают в стерильных условиях и готовят клеточную суспензию: селезенки помещают во флакончики со средой, расстригают ножницами, многократно пропускают через шприц с иглами уменьшающегося диаметра, фильтруют через металлическую сетку и три раза отмывают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин со сменой среды. Осадок клеток селезенки ресуспендируют в полной среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной сыворотки телят, 10 мМ Hepes, 4 • 10-5 М 2-меркаптоэтанола, 2мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина, и подсчитывают их общее количество. Полученную клеточную суспензию доводят до концентрации 0,7 • 106клеток/мл полной среды и помещают в 96-луночные круглодонные планшеты для культивирования по 100 • 103 клеток/лунку в объеме 150 мкл/лунку. Добавляют оптимальные дозы митогенов Л ПС — Е. coli 055: В5, Кон A, PWM, определенные в предварительных опытах: 30, 2 и 1 мкг/мл соответственно в объеме 10 мкл. Для оценки спонтанной пролиферации в лунки добавляют 10 мкл среды RPMI-1640. Все пробы проводят в триплетах. Инкубацию клеточной культуры проводят при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% С02, в течение 72 ч. Пролиферативную активность клеток оценивают по включению Н3-тимидина в ДНК делящихся клеток. Метку вносят за 16 ч до конца культивирования по 1 мкКи в каждую лунку планшета. Для этого основной раствор Н3-тимидина сначала растворяют в среде RPMI-1640 до концентрации 100 мкКи/мл, а затем в каждую лунку планшета добавляют по 10 мкл раствора. По окончании инкубации клетки собирают на стекловолокнистые фильтры (Flow Laboratories Ltd, Великобритания) с помощью аппарата Harvester (Titertek, Норвегия). Фильтры помещают во флаконы для сцинтилляционного счета. Радиоактивность подсчитывают в сцинтилляторе (4 г дифенилокса- зола и 0,1 г дифенилоксазолил бензол а на 1 л толуола) в жидкостном сцинтилляционном счетчике Delta (США). Результаты оценивают в имп/мин на 100 • 103 клеток, затем подсчитывают средние значения по триплету. Оценка результатов проводится как в абсолютных значениях, так и в индексах стимуляции (ИС).

где А^мип — митогениндуцированная пролиферация, имп/мин; Ncn — спонтанная пролиферация, имп/мин.

Результаты экспериментов представляются в виде среднего счета (имп/мин) из трех идентичных культур.

Проведение РБТЛ целесообразно в случае: первичных иммунодефицитов, связанных с нарушениями клеточного иммунитета; вторичных иммунодефицитов, связанных с нарушениями клеточного иммунитета, которые развиваются вследствие воздействия на организм какого-либо повреждающего фактора (острых и хронических вирусных инфекций, злокачественных заболеваний); физиологических иммунодефицитов, например при старении, когда ослабление иммунитета затрагивает реакции, обусловленные Т-клетками, что служит одной из причин повышения частоты опухолей в старости, аутоиммунных заболеваний.

Метод включает следующие процедуры. Выделение клеток. Используют мононуклеарные клетки из периферической крови человека или животного. Забор крови производят натощак в стерильную пробирку с гепарином (20 ME на 1 мл крови). От забора крови до начала выделения мононуклеарных клеток должно пройти не более 3 ч. Кровь в это время хранится при комнатной температуре в плотно закрытой пробирке. Перед разведением ее следует перемешать. Гепаринизированную кровь разводят в два раза средой 199, затем наслаивают на градиент плотности фиколл-пака (8 мл разведенной крови на 2 мл фиколла в центрифужной пробирке). Пробирки центрифугируют 30—40 мин при 400 g. Затем отбирают образовавшееся в интерфазе «кольцо» мононуклеаров. После этого клетки дважды отмывают центрифугированием в среде 199. Концентрацию клеток доводят до 2 • 106клеток/мл полной культуральной средой. Их жизнеспособность после выделения должна составлять не менее 95%, что определяют по включению 0,2%-го трипанового синего.

Мононуклеары культивируют в 150 мкл ПКС (полной культуральной среды — питательной среды, содержащей все необходимые для культивирования компоненты: эмбриональную телячью сыворотку, 2-меркаптоэтанол, гентамицин) в 96-луночных круглодонных планшетах при 37 °С в атмосфере 5%-го С02 в течение 72 ч в присутствии вышеуказанных митогенов в рабочих концентрациях. В качестве контроля используют клетки, инкубированные только в присутствии среды. За 6 ч до окончания реакции в каждую лунку добавляют Н3-тимидин 118

в концентрации 1 мкКи. По окончании реакции клеточную взвесь переносят на стекловолокнистые фильтры. Высушенные в течение ночи фильтры переносят в сцинтилляционные флаконы с 3 мл сцин- тилляционной жидкости и подсчитывают включения радиоактивной метки: в культуре со средой — спонтанная бласттрансформация, с фи- тогемагглютинином — ФГА-индуцированная бласттрансформация, с митогеном лаконоса — МЛ-индуцированная бласттрансформация. Результаты выражают в импульсах в минуту (имп/мин) и в виде индекса стимуляции — отношения включения метки в присутствии митогена к включению метки в присутствии только среды.

Следует отметить, что данная методика разработана только для определенных митогенов, которые обладают неспецифическим воздействием на клетки. Исследования проводится in vitro. У исследователя могут возникать вопросы при экстраполяции полученных при помощи данного теста результатов на реальное состояние Т- и В-зве- ньев иммунитета и иммунитета в целом. Для выявления специфического ответа лимфоцитов на антигены требуется более длительное (до 7 сут) культивирование клеток. Поэтому сам по себе показатель активности лимфоцитов не должен служить единственным изучаемым критерием при клеточных иммунопатологиях самого различного генеза. Известно, что обусловленная терапией «нормализация мито- гензависимой активности» не обязательно развивается параллельно с улучшением клинической картины. Снижение пролиферативного ответа на митогены в большинстве случаев является косвенным доказательством наличия клеточного иммунодефицита, но механизмы последнего могут быть различными. Только в комплексе с другими количественными и особенно качественными характеристиками иммунной системы метод может дать наиболее полную информацию о состоянии иммунитета, выявлении конкретного иммунологического дефекта, а следовательно, подобрать адекватное лечение и (или) способ иммунокоррекции.

В зависимости от качества используемых реагентов, а также условий культивирования интенсивность стимуляции может быть различной, поэтому:

  • • необходимо использовать инактивированную эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС);
  • • для большей информативности этот анализ нужно проводить лишь в комплексе с другими показателями и оценкой клинической картины в целом, а для исследования функциональной активности лимфоцитов — с синтезом цитокинов, определением активности N К-клеток и др.;
  • • необходимо осознавать, что реальную информацию об изменении параметра несут лишь сильные сдвиги показателя (±20—40% от нормы и более);

надо понимать, что для диагностической и прогностической оценки иммунитета важнейшее значение имеет индивидуальный показатель нормы у данного больного (особенно с учетом возраста и наличия хронических заболеваний);

при оценке функциональной активности лимфоцитов, как и при оценке других показателей иммунограммы, следует прежде всего исключить возможность их колебания в связи с приемом пищи, физическими нагрузками, стрессом, временем суток и др.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ И ЗАДАНИЯ

  • 1. Укажите прямые и непрямые методы регистрации иммунного ответа.
  • 2. Какими методами определяют классы иммуноглобулинов?
  • 3. Назовите методы индикации антителообразующих клеток.
  • 4. Кратко изложите методику определения первичного гуморального иммунного ответа in vivo.
  • 5. В чем сущность метода проточной цитофлуориметрии?
  • 6. Укажите сущность метода реакции бласттрансформации лимфоцитов.

Использованная литература

  • 1. Кисленко В.Н. Ветеринария, микробиология и иммунология: Практикум. СПб., 2012.
  • 2. РойтЛ. Основы иммунологии. М., 1991.
  • 3. Руководство по микробиологии и иммунологии / Под ред. Н.М. Колычева и В.Н. Кисленко. Новосибирск, 2010.
  • 4. Хант С. Лимфоциты. Методы. 1990.
  • 5. Хоробрых В.В., Пронин В.А., Киркин Ф.А., Санин В.А. Методы постановки реакции бласттрансформации в микромодификации // Иммунология. 1983. № 3.
 
Посмотреть оригинал
Если Вы заметили ошибку в тексте выделите слово и нажмите Shift + Enter
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >
 

Популярные страницы