Меню
Главная
Авторизация/Регистрация
 
Главная arrow Агропромышленность arrow Ветеринарная иммунология (теория и практика)

Реакции агглютинации (РА)

Реакция агглютинации — реакция склеивания корпускулярных АГ (микробов, эритроцитов и т.д.) специфическими АТ. Образовавшийся при этом комплекс выпадает в осадок. Эту реакцию проводят для определения наличия определенных АГ или АТ. На стекле к капле сыворотки добавляется взвесь бактерий, выделенных от больного. Если капля мутнеет, значит, агглютинация произошла, и в организме присутствует тот АГ, к которому были АТ (известные) в исходной сыворотке. Также эту реакцию проводят в пробирке. Для этого в несколько пробирок наливают сыворотку крови больного с неизвестными АТ, потом к этим образцам добавляют известные диагностикумы (убитые бактерии) и наблюдают, в какой пробирке произойдет помутнение или выпадение осадка.

Реакция агглютинации является двухфазной: в первой фазе происходит специфическое связывание АГ и АТ, во второй — осаждение солями образовавшегося агрегата, являющегося гидрофобным. Основываясь на этом представлении, принято разделять агглютинины на полные и неполные. Неполные АТ — агглютинины, которые из физиологического раствора не могут осаждать клетки или частицы, даже если они связываются с ними. Классификация агглютининов, основанная на методах их выявления:

I. Полные агглютинины.

II. Неполные агглютинины:

  • 1) блокирующие АТ, определяемые в тесте блокирования;
  • 2) агглютиноиды, определяемые в среде сыворотки, плазмы, альбумина;
  • 3) неполные АТ, выявляемые с помощью антиглобулиновой реакции Кумбса;
  • 4) криптагглютиноиды, выявляемые после предварительной обработки эритроцитов ферментами;
  • 5) агглоиды, обнаруживаемые с помощью коллоидных посредников (поливинилпирролидона, желатина, декстрана и др.).

Полные и неполные агглютинины находятся в основном в у-гло- булиновой фракции сыворотки крови. В процессе иммунизации сначала появляются полные АТ, в случае продолжающейся сенсибилизации появляются АТ, способные вызвать агглютинацию лишь при определенных условиях.

Полные и неполные АТ отличаются по физико-химическим свойствам и серологической характеристике. Так, неполные АТ более термостабильны по сравнению с полными, в то время как полные менее устойчивы и снижают свою активность даже при хранении в замороженном состоянии. Полные АТ имеют большую авидность к соответствующим АГ по сравнению с неполными.

Реакция гемагглютинации. Реакцию агглютинации эритроцитов, или гемагглютинации (РТА), широко используют для обнаружения антиэритроцитарных АТ (определения групп крови), а также АГ в исследуемых образцах эритроцитов или тканей с помощью специфических антисывороток.

Агглютинация в солевой среде — наиболее простой метод выявления полных агглютининов. Реакцию можно проводить как на плоскости (более быстрый метод), так и в пробирках (для более точного количественного учета АТ в сыворотке). Для реакции необходимы исследуемая сыворотка или сыворотка известной специфичности и взвесь эритроцитов, приготовленная из свежевзятой крови, отмытой от примеси плазмы физиологическим раствором. С этой целью в пробирку с 8—10 мл физиологического раствора добавляют несколько капель крови, перемешивают и центрифугируют в течение 5—7 мин при 3000 об/мин. Затем сливают надосадочную жидкость, к осадку эритроцитов добавляют физиологический раствор до нужного объема, перемешивают путем встряхивания и вновь центрифугируют. После троекратного отмывания из осадка эритроцитов готовят 2—5%-ю взвесь эритроцитов в физиологическом растворе.

Агглютинация в пробирках (планшете для агглютинации). В ряд агглютинационных пробирок (кроме первой) вносят по 0,1 мл (две капли) физиологического раствора. Затем в первую и вторую пробирки добавляют по 0,1 мл (две капли) тестируемой сыворотки и, начиная со второй пробирки, переносят после перемешивания пипеткой по 0,1 мл (две капли) разведенной сыворотки в каждую последующую пробирку, получая, таким образом, ряд разведений сыворотки, кратных двум. Затем в каждую пробирку вносят по 0,05 мл (одна капля) 2%-й взвеси эритроцитов. В качестве контроля берут нормальную сыворотку и физиологический раствор с используемой взвесью эритроцитов. После встряхивания пробирки помещают в термостат с температурой 37 °С на 30-60 мин или выдерживают при комнатной температуре (18 °С) либо при температуре 4 °С (в зависимости от задач исследования). После инкубации проводят оценку реакции без предварительного центри- 124

фугирования по форме осадка или после центрифугирования (при 1500 об/мин в течение 1 мин) по характеру сгустка. Для более точного учета результатов реакции используют агглютиноскоп, микроскоп (просматривают под малым увеличением) или лупу. Интенсивность агглютинации оценивается по следующей схеме:

  • • резко выраженная агглютинация (++++). При встряхивании комочек эритроцитов не разбивается, жидкость совершенно прозрачна. Под микроскопом все поле зрения занято одним агглютинатом;
  • • умеренная агглютинация (++). Осадок при встряхивании разбивается на несколько отдельных комков, небольшая часть эритроцитов находится в свободном состоянии и хорошо выявляется под микроскопом;
  • • слабая агглютинация (+). Агглютинаты мелкие, большая часть эритроцитов взвешена в жидкости. Под микроскопом на фоне отдельных эритроцитов видны небольшие агглютинаты;
  • • отрицательная реакция (—). Гомогенная мутная взвесь эритроцитов в жидкости, под микроскопом склеенные эритроциты не выявляются.

Наибольшее разведение сыворотки, при котором еще обнаруживается агглютинация эритроцитов, принимается за титр агглютининов.

Реакция агглютинации при бактериальных инфекциях. Реакция агглютинации в инфекционной иммунологии широко применяется для диагностики различных инфекционных заболеваний, для идентификации микроорганизмов, выделенных от больных и бактерионосителей. Реакция агглютинации применяется для решения вопросов диагностики в двух аспектах: 1) диагностика заболевания путем обнаружения в крови больного АТ к соответствующему виду микроба; 2) идентификация микроба, выделенного из организма больного или из внешней среды с помощью известной агглютинирующей сыворотки.

Для постановки реакции агглютинации необходимы три основных компонента: сыворотка, АГ (диагностикум) и физиологический раствор. В качестве АГ чаще всего применяют готовые диагности- кумы, которые представляют собой микробы, убитые тем или иным способом, в виде взвеси определенной концентрации или в высушенном состоянии. АГ может также служить взвесь, приготовленная из любой лабораторной культуры микробов, при условии сохранения ими типичных свойств и отсутствия спонтанной агглютинации в физиологическом растворе. Достоверными можно считать результаты реакции только при хороших четких контролях. За титр АТ принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация не менее чем ++.

Реакция непрямой гемагглютинации (РИГА). РИГА применяют в двух вариантах: с известными АГ для обнаружения АТ или с известными АТ для выявления АГ. Эта реакция специфична, и применяют ее для диагностики заболеваний, вызванных бактериями и риккетсиями. Для постановки Р Н ГА используют эритроцитарные диагностикумы, приготовленные путем адсорбции на эритроцитах АГ или АТ в зависимости от цели исследования (рис. 9.1). В положительных случаях степень агглютинации эритроцитов отмечают плюсами. Четырьмя плюсами оценивают реакцию, имеющую вид тонкой пленки из склеившихся эритроцитов (зонтик), покрывающей дно пробирки; наличие пленки с фестончатыми кружевными краями обозначают двумя плюсами. За титр принимают предельное разведение исследуемого материала, вызвавшее агглютинацию эритроцитов на два плюса.

РИГА (по Бургасовой и Безденежных, 1969)

Рис. 9.1. РИГА (по Бургасовой и Безденежных, 1969):

1 —эритроциты; 2—АГ эритроцита; 3 — конъюгированный АГ; 4 — АТ

РГА и реакция торможения гемагглютинации (РТГА). Как уже отмечалось, в основе РГА лежит способность эритроцитов склеиваться при адсорбции на них определенных АГ. В качестве исследуемого материала при гемагглютинации используют аллантоисную, амниотическую жидкость, суспензию хорион-аллантоисных оболочек куриных эмбрионов, взвеси и экстракты из культур или органов животных, зараженных вирусами, нативный инфекционный материал. РГА не является серологической реакцией, поскольку происходит без участия иммунной сыворотки и используется для выбора рабочего разведения АГ для постановки РТГА или определения наличия АГ (вируса) в исследуемом материале (например, при гриппе). В реакции используются эритроциты животных, птиц, человека с I (0) группой крови. Для постановки ориентировочной РГА на предметное стекло наносят каплю 5%-й взвеси эритроцитов и каплю испытуемого материала, все тщательно смешивают. При положительном результате через 1—2 мин макроскопически наблюдают появление хлопьевидной агглютинации эритроцитов. Для постановки РГА в развернутом ряду в лунках полистироловых планшетов готовят двукратно возрастающие разведения исследуемого материала на физиологическом растворе в объеме 0,5 мл. Во все пробирки вносят по 0,5 мл 0,25—1%-й взвеси эритроцитов. Результаты учитывают после полного оседания эритроцитов в КОНТУР роле (эритроциты + физиологический раствор). Реакцию учитывают по характеру осадка эритроцитов. В положительных случаях степень агглютинации отмечают плюсами. Четырьмя плюсами оценивают реакцию, имеющую вид тонкой пленки из склеившихся эритроцитов, покрывающей дно пробирки (зонтик). Реакцию с просветами в пленке отмечают тремя плюсами. Наличие пленки с фестончатыми кружевными краями из склеившихся эритроцитов обозначают двумя плюсами. Хлопьевидный осадок эритроцитов, окруженный зоной комочков агглютинированных эритроцитов, соответствует одному плюсу. Резко очерченный осадок эритроцитов, неотличимый от контроля, показывает отсутствие агглютинации. За титр принимают предельное разведение исследуемого материала, вызвавшее агглютинацию эритроцитов на два плюса.

При положительном результате РГА исследование продолжают, определяя тип выделенного вируса с помощью РТГА типоспецифическими сыворотками. РТГА основана на свойстве антисыворотки подавлять вирусную гемагглютинацию, так как нейтрализованный специфичными АТ вирус утрачивает способность агглютинировать эритроциты. При ориентировочном типировании вирусов используют капельный метод на стекле. Для окончательного установления типовой принадлежности выделенного вируса и титрования АТ в сыворотках ставят развернутую РТГА в пробирках или в лунках. С этой целью готовят двукратные разведения сывороток на физиологическом растворе и разливают по 0,25 мл. К разведениям сыворотки прибавляют по одной капле материала, содержащего вирус, и по одной капле 1 %-й взвеси эритроцитов. При применении РТГА для определения типа вируса используют типоспецифические сыворотки, которые добавляют к равному объему рабочего разведения АГ. Типовую принадлежность выделенного вируса устанавливают по специфической иммунной сыворотке, показавшей наивысший титр АТ к этому вирусу. РГА и РТГА широко применяются для диагностики вирусных инфекций (клещевого энцефалита, гриппа и др.) с целью обнаружения специфических АТ и идентификации многих вирусов по их АГ.

Реакция пассивной гемагглютинации. Для определения АТ к ДНК чаще используют реакцию пассивной гемагглютинации. С этой целью АГ (Д Н К) сначала осаждают на эритроцитах барана, а затем добавляют к ним исследуемую сыворотку. Если в сыворотке содержатся АТ к ДНК, происходят агглютинация эритроцитов и их гемолиз. В зависимости от типа используемого АГ удается выделить несколько типов АТ к ДНК: I тип — АТ к односпиральной ДНК, II тип — АТ к термоденатурированной ДНК, III тип — АТ к нативной двуспиральной ДНК. Определение типа АТ позволяет проводить дифференциальную диагностику различных заболеваний (см. ниже).

Неполные АТ к эритроцитам обнаруживаются при помощи прямой и непрямой пробы Кумбса. Непрямая проба Кумбса основана на выявлении агглютинации эритроцитов, нагруженных неполными АТ, которая появляется при добавлении антиглобулиновой сыворотки. Проба осуществляется в два этапа. Сначала проводится сенсибилизация стандартных резус-положительных эритроцитов донора с О (I) группой крови. Каплю взвеси эритроцитов вносят в пробирку, наслаивают на них несколько капель исследуемой сыворотки, в которой предполагают наличие АТ к эритроцитам, и инкубируют 40 мин при 37 °С. Эритроциты осторожно отмывают от сыворотки физиологическим раствором. Неполные АТ, если они присутствуют в исследуемой сыворотке, фиксируются на эритроцитах, но не могут вызвать их агглютинацию (рис. 9.2, а). На втором этапе пробы на сухую тарелку наносят каплю стандартной антиглобулиновой сыворотки, содержащей АТ к человеческим иммуноглобулинам, и добавляют туда эритроциты, на которых предположительно фиксированы неполные АТ исследуемой сыворотки. Если на предыдущем этапе исследования на поверхности эритроцитов действительно фиксировались проти- воэритроцитарные АТ, то последние взаимодействуют с АТ к иммуноглобулину стандартной антисыворотки (рис. 9.2, б). В результате происходит агглютинация (склеивание) эритроцитов.

Схема проведения непрямой пробы Кумбса (по Бургасовой и Безденежных, 1969)

Рис. 9.2. Схема проведения непрямой пробы Кумбса (по Бургасовой и Безденежных, 1969): а и б — первый и второй этапы исследования

При применении пробы Кумбса используют собственные эритроциты пациента, которые предположительно уже были сенсибилизированы аутоАТ. Эритроциты добавляют в антиглобулиновую сыворотку: при наличии на их поверхности фиксированных иммуноглобулинов (АТ к эритроцитам) возникает агглютинация эритроцитов. АутоАТ к эритроцитам обнаруживают: при аутоиммунных гемолитических анемиях; при гемолитической болезни новорожденных; при системных заболеваниях соединительной ткани; при хроническом активном гепатите и других заболеваниях.

 
Посмотреть оригинал
Если Вы заметили ошибку в тексте выделите слово и нажмите Shift + Enter
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >
 

Популярные страницы