Меню
Главная
Авторизация/Регистрация
 
Главная arrow Агропромышленность arrow Ветеринарная иммунология (теория и практика)

Иммуноферментный анализ

ИФА или ELISA (отангл. enzyme-linked immuno sorbent assay) — лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения АГ.

ИФА также основан на учете реакции АГ—АТ, причем в качестве метки, позволяющей обнаружить иммунный комплекс, используют ферменты, например пероксидазу. В основе ИФА лежит принцип взаимодействия иммуносорбента (АГ возбудителя инфекции) с выявляемыми АТ соединения комплекса АГ—АТ с иммуноглобулинами, содержащими ферментную метку.

Иммуноглобулины, применяемые в таких тест-системах, так называемый конъюгат, могут быть получены на основе антивидовых АТ (например, кроличьи АТ против иммуноглобулинов человека) или на основе АТ, направленных против человеческих иммуноглобулинов определенного класса (М, G, А).

В зависимости от того какие АТ использованы, тест-система будет выявлять в исследуемом образце или специфические АТ независимо от их класса, или АТ лишь определенного класса (например, только иммуноглобулин G или только иммуноглобулин М).

Существует несколько методов постановки реакции, однако в настоящее время используется в основном следующая схема (рис. 9.7).

Схема проведения ИФА (по Бургасовой и Безденежных,1969)

Рис. 9.7. Схема проведения ИФА (по Бургасовой и Безденежных,1969): а — АТ против АГ сорбированы на стенках пробирки; 6 — добавление исследуемой сыворотки к искомым АГ, которые взаимодействуют с АТ и фиксируются на стенках пробирки; в — введение АТ к данному АГ, меченных ферментом (пероксидазой), которые также фиксируются на стенках пробирки; г—добавление перекиси водорода и хромогена, который под действием кислорода, выделяющегося при разложении Н202 пероксидазой, изменяет свой цвет на желтый

Сначала на стенках полистироловых пробирок сорбируют АТ против определенного АГ. В эту же пробирку вносят исследуемую сыворотку (или другой биологический субстрат). Если там содержатся искомые АГ, то они взаимодействуют с АТ и вместе с ними фиксируются на стенках пробирки. После этого в пробирку вводят АТ к данному АГ, меченные ферментом, которые также присоединяются к образовавшемуся иммунному комплексу и остаются на стенках пробирки. Для обнаружения и количественной оценки этих комплексов в пробирку добавляют перекись водорода (Н202) и хромогены. Фиксированный к стенке пробирки фермент (пероксидазу) разлагает Н202 с выделением кислорода. Последний окисляет хромоген, который приобретает желтый цвет. Интенсивность окрашивания и соответственно количество искомого АГ оценивают спектрофотометрически или визуально.

Наиболее распространен твердофазный ИФА (рис. 9.8), в котором один из компонентов иммунной реакции (АГ или АТ) сорбирован на твердом носителе. В качестве твердого носителя используются микропанели из полистирола. При определении АТ в лунки с сорбированным АГ последовательно добавляют сыворотку крови больных, анти- глобулиновую сыворотку, меченную ферментом, и смесь растворов субстрата для фермента и хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента путем тщательного промывания из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только АГ, но и АТ. Тогда в лунки с сорбированными АТ вносят искомый АГ, добавляют иммунную сыворотку против АГ, меченную ферментом, а затем — смесь растворов субстрата для фермента и хромогена. ИФА применяют для диагностики заболеваний, вызванных вирусными и бактериальными возбудителями.

По такому принципу построена основная масса тест-систем для иммуноферментной диагностики различных инфекций: ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов, цитомегаловирусной, герпесной, токсоплазменной и других инфекций. Однако следует отметить, что иммуноферментный анализ может давать и ложные результаты. Ложноположительные результаты могут возникнуть за счет ревматоидного фактора, представляющего собой иммуноглобулин М против собственных иммуноглобулинов G человека; за счет АТ, образующихся при различных системных заболеваниях, нарушениях обмена или приеме лекарственных препаратов. У новорожденных такие ложноположительные реакции могут возникать за счет образования в организме ребенка М-АТ к иммуноглобулину G матери. Ложноотрицательные результаты реакции обусловлены конкуренцией между иммуноглобулинами М и G, а также техническими ошибками при постановке реакции.

ИФА, выявление АГ прямым и непрямым методами твердофазного ИФА (по Бургасовой и Безденежных, 1969)

Рис. 9.8. ИФА, выявление АГ прямым и непрямым методами твердофазного ИФА (по Бургасовой и Безденежных, 1969)

В зависимости от того, какие АГ используются, все иммунофер- ментные тест-системы для выявления АТ подразделяются:

  • 1) на лизатные, в которых используется нативный АГ (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре);
  • 2) рекомбинантные, в которых используются полученные генно- инженерным способом белки — аналоги определенных белковых АГ возбудителя;
  • 3) пептидные, использующие химически синтезированные фрагменты белков.

Общее направление развития ИФА-диагностикумов — это направление от лизатных тест-систем, которые принято называть тест- системами первого поколения, к рекомбинантным и пептидным. Технология наработки рекомбинантных белков позволяет получить в достаточно чистом виде аналог любого отдельного АГ.

Для создания высококачественной рекомбинантной тест-системы необходимо из всего антигенного многообразия возбудителя выбрать АГ, которые были бы высокоиммуногенными (т.е. в организме инфицированного человека должны вырабатываться АТ к этим АГ в достаточно большом количестве) и высокоспецифичными (т.е. характерными лишь для данного возбудителя и не дающими перекрестных реакций с АТ другой природы).

Кроме того, большое значение имеет качество очистки рекомбинантных белков. В идеальном случае возможно получение рекомбинантной тест-системы практически со 100%-й специфичностью при высокой чувствительности. На практике этого не всегда удается достичь, однако специфичность лучших рекомбинантных тест-систем приближается к 100%.

Таким образом, за счет несомненных преимуществ — удобства в работе, быстроты, объективности за счет автоматизации учета результатов, возможности исследования иммуноглобулинов различных классов (что важно для ранней диагностики заболеваний и их прогноза) — иммуноферментный анализ в настоящее время является одним из основных методов лабораторной диагностики.

Иммуноферментный метод включает следующие основные этапы. Используются специальные планшеты из полистирола с круглыми плоскодонными лунками вместимостью около 300 мкл. Число лунок на планшете — 96 (8 рядов по 12 лунок).

Перед анализом планшет сенсибилизируют, нанося раствор АГ. Обычно это не целая структура возбудителя, а часть (наиболее характерная) белков его оболочки. Очень часто АГ для И ФА получают с помощью генно-инженерных технологий, выращивая их на трансгенных Е. coli.

Растворимые АГ закрепляются на поверхности планшета непосредственно из раствора с помощью ряда специфических взаимодействий. Для снижения помех участки незанятой АГ поверхности «укрывают», нанося раствор бычьего сывороточного альбумина. Несвязанный материал удаляют и планшет сушат. Сенсибилизированные планшеты можно хранить при — 18 °С не более двух недель.

При выполнении анализа лунки заполняют исследуемым материалом (сывороткой крови), нанося его в разные лунки с дробным разбавлением (1/2, V4, V8, V16, V32 и т.д.), после чего выдерживают около 30 мин для связывания. Если в образцах имеются АТ, комплементарные нанесенному АГ, они образуют с ним прочные комплексы. Образцы из лунок удаляются, а несвязавшийся материал удаляется трехкратной промывкой буфером. Далее лунки заполняются раствором конъюгата, представляющего собой связанные глутаровым альдегидом молекулы белка-фермента (чаще всего пероксидазы хрена или щелочной фосфатазы) и молекулы АТ против АТ к возбудителю, полученные из сыворотки кролика (или другого организма) при введении в его кровь АТ человека к искомому возбудителю. Дают время на прохождение реакции комплементарного связывания, после чего избыток раствора конъюгата удаляется и лунки промываются буфером. Молекулы конъюгата осаждаются на молекулах осадившихся на АГ АТ из испытуемого образца. В довершение всего лунки заполняют раствором субстрата, превращение которого в окрашенный продукт осуществляется конъюгированным ферментом. Такое ферментативное превращение осуществляется примерно в течение 60 мин, после чего реакция останавливается посредством добавления кислоты. Количество превращенного субстрата пропорционально концентрации конъюгата, а следовательно, концентрации АТ против возбудителя в исследуемом образце. По плотности окраски в УФ-свете можно судить о концентрации АТ в исследуемой сыворотке. В «холостых» контрольных лунках параллельно проводят реакцию, позволяющую установить порог «шумов». Имеются также лунки, заполненные АТ из контрольного раствора и позволяющие проверить специфичность реакции.

В качестве субстратов для конъюгатов с пероксидазой хрена применяется о-фенилендиамин в смеси с перекисью водорода, дающий после остановки реакции оранжево-коричневые растворы, измеряемые при X = 492 нм. Субстратом для щелочной фосфатазы является n-нитрофенилфосфат, превращающийся в n-нитрофенол, индицируемый при X = 405 нм.

И ФА повышает чувствительность анализа благодаря «усилению сигнала» на конъюгированном ферменте. На каждую молекулу исследуемого в сыворотке АТ «садится» по одной молекуле фермента, которая способна катализировать превращение десятков и сотен тысяч молекул субстрата. Однако и чувствительность ИФА имеет ограничения. В некоторых случаях (например, при приеме донорской крови) требуется проводить процедуру ПЦР для подтверждения отсутствия АТ к ВИЧ и некоторым другим заболеваниям. Дело в том, что в первые дни после заболевания количество АТ в крови может оказаться настолько малым, что ИФА даст так называемую «серонегативную реакцию».

Иммуноферментным методом в исследуемом материале выявляют специфические антигены микроорганизмов. Несмотря на такие преимущества ИФА, как относительная простота выполнения, экс- прессность и высокая специфичность, данный метод все же имеет ряд недостатков. Во-первых, обнаруживаемые антигены патогенных микроорганизмов (белки, гликопротеиды, липопротеиды, гликолипиды) не дают информации об их жизнеспособности, так как указанные соединения выявляются и после гибели клеток. Во-вторых, метод недостаточно чувствителен при исследовании образцов с низким уровнем микробной контаминации. Кроме того, его чувствительность может 142

дополнительно снижаться из-за ингибирующего влияния компонентов исследуемого образца на активность фермента.

Современные методы иммунологии позволяют обнаруживать в биологических средах ничтожно малые количества некоторых органических и неорганических веществ (гормонов, ферментов, витаминов, биологически активных веществ, АТ к определенным тканям и органам, лекарств и т.п.), которые не выявляются классическими биохимическими и иммунологическими методами. Наиболее чувствительными являются радиоиммунный и иммуноферментный методы исследования.

 
Посмотреть оригинал
Если Вы заметили ошибку в тексте выделите слово и нажмите Shift + Enter
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >
 

Популярные страницы