Меню
Главная
Авторизация/Регистрация
 
Главная arrow Агропромышленность arrow Ветеринарная иммунология (теория и практика)

ГЕНОДИАГНОСТИКА: ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР) В ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ

Метод ПЦР основан на многократном избирательном копировании определенного участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка ДНК, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах (репликации) с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований. С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определенных условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20—40 тыс. пар нуклеотидов (п.н.). Это все равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд пар оснований.

Компоненты реакции. Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты: ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать; два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента; термостабильная Д НК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза, используемая в ПЦР, должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и др.

Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — pH, ионную силу раствора, содержит соли, бычий сывороточный альбумин. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

Добавление пирофосфатазы может увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидролиз пирофосфата — побочного продукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК до ортофосфата. Пирофосфат может ингибировать ПЦР-реакцию.

Праймеры. Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами — короткими синтетическими олигонуклеотидами, длина которых — 18—30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, он обрамляет начало и конец амплифици- руемого участка. После гибридизации матрицы с праймером (отжиг) последний служит затравкой для Д НК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы (см. ниже). Важнейшая характеристика праймеров — температура плавления (Тт) комплекса праймер- матрица. Она определяется как температура, при которой праймер присоединился к половине возможных сайтов связывания. Верхний предел температуры плавления ограничен оптимумом температуры действия полимеразы, активность которой падает при температурах выше 80 °С.

При выборе праймеров желательно придерживаться следующих критериев: GC-состав ~ 40—60%; близкие Тт праймеров (отличия не более чем на 5 °С); отсутствие неспецифических вторичных структур — шпилек и димеров; желательно, чтобы на З'-конце был гуанин или цитозин, поскольку они образуют три водородные связи с молекулой матрицы, делая гибридизацию более стабильной.

Амплификатор. ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °С. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта», Touchdown ПЦР (см. ниже) и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °С. Для ПЦР в реальном времени выпускают приборы, оборудованные флуоресцентным детектором. Существуют также приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшета, что позволяет встраивать их в автоматизированные системы.

Ход реакции. Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий.

Денатурация. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94— 96 °С (или до 98 °С, если используется особенно термостабильная полимераза) и выдерживают при этой температуре 0,5—2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение приблизительно 2—5 мин для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой прием 144

называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

Отжиг. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4—5 °С ниже температуры их плавления. Время стадии — 0,5—2 мин. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к их связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре).

Элонгация. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки, — это стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от З'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °С. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, таки от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным 1 мин на каждую 1 тыс. пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7—10 мин.

Две получившиеся ДНК-цепи служат матрицей для следующего цикла, поэтому количество матричной ДНК в ходе каждого цикла удваивается.

Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) теоретически возрастает пропорционально 2п, где п — количество циклов реакции. На самом деле эффективность каждого цикла может быть меньше 100%, поэтому в действительности

где Р — количество продукта; Е — средняя эффективность цикла.

Количество «длинных» копий ДНК тоже растет, но линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент. Рост количества требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов. На последних циклах реакции рост замедляется — это называют «эффектом плато».

Метод ПЦР особенно эффективен при выявлении трудно культивируемых, некультивируемых, требующих сложной питательной среды и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях. Этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.

Диагностические возможности П ЦР не ограничены способностью микроорганизмов расти на искусственных средах или в культуре клеток. Поэтому основное преимущество ПЦР перед культуральными методами состоит не в высокой чувствительности ПЦР-метода (поскольку их чувствительность сопоставима), а в способности идентифицировать, определять свойства и работать с большим разнообразием микроорганизмов, которые не удается по тем или иным причинам размножать в лабораторных условиях.

Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов.

 
Посмотреть оригинал
Если Вы заметили ошибку в тексте выделите слово и нажмите Shift + Enter
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >
 

Популярные страницы