Меню
Главная
Авторизация/Регистрация
 
Главная arrow Агропромышленность arrow Ветеринарная иммунология (теория и практика)

Реакция агглютинации (РА)

Сущность РА заключается в том, что при добавлении сыворотки крови, содержащей специфические антигену антитела, в равномерной взвеси клеток происходит их склеивание, образование глыбок, комочков, хлопьев, которые постепенно оседают на дно пробирки, формируя характерный осадок — агглютинат, жидкость над ним просветляется. Характер агглютината зависит от антигенного строения микробной клетки (антигена). Если антигеном является взвесь неподвижных бактерий (без жгутиков), имеющих только соматический О-антиген, в течение 16—22 ч образуется мелкозернистый осадок. Если антигеном служит взвесь бактерий, имеющих жгутики (подвижные виды), и в агглютинации участвует наряду с соматическим еще жгутиковый Н-антиген, формируется крупнохлопчатый, крупнозернистый агглютинат. В ветеринарной практике РА используют для диагностики бруцеллеза, сальмонеллезов, колибактериоза, листериоза, вибриоза, лептоспирозов и других заболеваний. Существует несколько методов постановки РА: пробирочный (объемный), капельный (пластинчатый), кровяно-капельный, гемагглютинации, торможения гемаг- глютинации, антиглобулиновый Кумбса, кольцевая проба (реакция) с молоком по Кастеллани (метод адсорбции агглютининов).

Для определения антител (по известному антигену) берут 5—10 мл крови из яремной вены животного (у свиней — из хвостовой) в стерильные пробирки и помещают их в теплое место. После образования сгустка осторожно (стерильно!) отделяют его от стенок пробирки, обводя металлической проволокой (вязальной спицей), и ставят в холодное место для ретракции (отделения) сгустка. Сыворотку отсасывают в стерильные пробирки, нумеруют их, с нарочным и сопроводительным письмом отсылают в лабораторию.

В РА (как и вообще при серологических исследованиях) используют свежие сыворотки без гемолиза или консервированные фенолом, мертиолятом натрия или борной кислотой. Антиген для РА представляет собой взвесь в физиологическом растворе убитых или живых бактерий. Для диагностических целей рекомендуется стандартный антиген биофабричного производства.

Если же необходимо идентифицировать бактериальную культуру, выделенную из патологического материала, применяют стандартные сыворотки, а антиген готовят из суточной культуры — смыва с МПА. Специфические стандартные агглютинирующие сыворотки получают на биофабриках путем гипериммунизации животных соответствующим антигеном (специально подготовленной взвесью живых или убитых микробов, эритроцитами и др.). Готовую сыворотку консервируют, разливают в ампулы и запаивают. Нередко диагностические сыворотки подвергают лиофильному высушиванию. Перед употреблением такие сыворотки разводят дистиллированной водой. Но для постановки реакции (и промывания пипеток) ее разводят физиологическим раствором.

Постановка РА классическим (пробирочным)методом. Исследуемые сыворотки разводят в чистых сухих пробирках с ровным сферическим дном. Для каждой сыворотки берут отдельную пипетку. В зависимости от инфекции используют соответствующие степени разведения сывороток (согласно инструкции). Например, сыворотки разводят 1: 25; 1: 50; 1:100; 1: 200; 1:400.

Удобно разведения производить следующим образом. В отдельной пробирке готовят основное (исходное) разведение сыворотки —1:25, смешивая 0,1 мл испытуемой сыворотки с 2,4 мл физиологического раствора. В опытные пробирки разливают по 1 мл физиологического раствора. Затем из исходного разведения 1 мл жидкости переносят в первую опытную пробирку, смешивают с физраствором (разведение 1 : 50) и 1 мл переносят во вторую пробирку (1 : 100), из второй 1 мл — в третью и т.д. Из последней пробирки 1 мл выливают в сливную чашку, чтобы в каждой пробирке осталось по 1 мл разведенной сыворотки (рис. 9.9).

Схема постановки РА

Рис. 9.9. Схема постановки РА

Во все пробирки добавляют по две капли стандартного антигена (концентрация 10 млрд микробных тел в 1 мл), смешивают встряхиванием и выдерживают в термостате 4—6 ч при 37 °С, а затем при комнатной температуре 14—16 ч.

При постановке РА (как при каждой серологической реакции) обязательно проведение контроля: в тех же разведениях испытывают сыворотку нормальную (от здорового животного) и позитивную (от заведомо больного животного или стандартную биофабричного производства) с тем же антигеном.

Компоненты при постановке реакции вносят в пробирки индивидуальными мерными пипетками с резиновыми грушами или дозаторами, групповыми дозаторами (рис. 9.10 и 9.11) и автоматическими пипетками с изменяющимися объемами (5—250 мкл).

Прибор Такачи — аппарат для микротитрования

Рис. 9.10. Прибор Такачи — аппарат для микротитрования:

7 — общий вид; 2, а, б, в, г— последовательность работы с аппаратом Такачи

Одиночные и групповые автоматические пипетки

Рис. 9.11. Одиночные и групповые автоматические пипетки

Для контроля антигена в 1 мл физиологического раствора добавляют две капли антигена для исключения самоагглютинации.

Учет РА проводят невооруженным глазом или с помощью агглю- тиноскопа, начиная с контрольных пробирок. Результат РА принято выражать количеством крестов:

++++ (#) — полное просветление жидкости, образовавшийся агглютинат имеет вид перевернутого зонтика, при встряхивании он разбивается в глыбки, хлопья разной величины, жидкость остается прозрачной;

+ + + (///) — неполное просветление жидкости, агглютинат, как и в предыдущем случае, имеет вид зонтика, при встряхивании разбивается на более мелкие глыбки, комочки;

+ + (++) — так обозначают неполную реакцию агглютинации с неполным просветлением жидкости, агглютинат имеет вид зонтика, но при встряхивании разбивается на хлопья разной величины, жидкость мутная;

+ — наличие небольшого нехарактерного осадка в виде «пуговки», жидкость над ним мутная. При встряхивании такой осадок легко разбивается, увеличивая мутность;

— (минус) — вся жидкость в пробирке мутная, на дне пробирки небольшой осадок антигена с ровными краями в виде «пуговки», при встряхивании он разбивается в равномерную муть.

Результаты РА, показавшие 3—4 креста, учитывается как положительная степень проявления агглютинации, два креста — сомнительная, один крест или отсутствие агглютината — отрицательный результат. Реакцию оценивают не только по степени выраженности РА (++ + + , + + + или + +), но и по высоте титров, т.е. степени разведения сывороток, давших положительный результат РА. Например, при диагностике бруцеллеза крупных животных диагностическим титром считают положительный результат РА с сывороткой в разведении не ниже 1:100, при сальмонеллезном аборте кобыл — выше 1 : 500.

Капельный (пластинчатый)метод постановки РА используют для быстрого обследования поголовья животных в лаборатории и в условиях хозяйства. На чистую стеклянную пластинку наносят микропипеткой по 0,04; 0,02; 0,01 и 0,005 мл исследуемой сыворотки. К каждой сыворотке добавляют по одной капле антигена определенной концентрации, постепенно их смешивают чистой стеклянной палочкой, начиная с наименьшего количества сыворотки. Условно считают, что сыворотка в первой капле соответствует разведению 1 : 50, во второй — 1 : 100, в третьей — 1 : 200, в четвертой — 1 :400. Через 2—3 мин производит учет. Для ускорения реакции стекло слегка подогревают высоко над пламенем горелки.

Положительный результат — образование в капле сыворотки комплекса антиген—антитело в виде крупинок, хлопьев, жидкость становится прозрачной. При отрицательном результате капля смеси сыворотки и антигена остается равномерно мутной (отсутствие в сыворотке антител).

Этим методом РА пользуются также для ориентировочного определения вида микроба или его идентификации (типизации). На предметное стекло наносят каплю известной специфической сыворотки и отдельно каплю физраствора (для контроля). В каждую каплю добавляют культуру испытуемого микроба в количестве, взятом бактериологической петлей, и равномерно размешивают. Положительная реакция указывает на гомологичность антигена с известным антителом.

Кровяно-капельный метод постановки РА чаще всего применяют для диагностики пуллороза (сальмонеллеза птиц) и бруцеллеза. На обезжиренное предметное стекло наносят каплю цельной крови (взятой у птиц из гребешка или сережки), в нее добавляют каплю соответ- 156

ствующего антигена и смешивают стеклянной палочкой. Для лучшей видимости феномена агглютинации биопромышленность выпускает антиген, подкрашенный гематоксилином.

В положительных случаях РА (когда в крови имеются специфические антигену антитела) через 30—60 с в капле смеси появляются глыбки, хлопья склеенного антигена (агглютинат).

Кольцевую пробу {реакцию) с молоком в основном используют при обследовании крупного рогатого скота на бруцеллез и при контроле сборного молока. В агглютинационные пробирки наливают по 2—3 мл свежего цельного молока и добавляют по 0,2 мл (2 капли) антигена (окрашенного гематоксилином). Пробирки встряхивают до равномерного окрашивания молока, выдерживают на водяной бане (или в термостате) при 37 °С 45—60 мин. Если в молоке имеются антитела, образуется комплекс антиген—антитело, который адсорбируется на капельках жира и при отстаивании всплывает наверх, образуя синее кольцо в нижнем слое сливок; столбик молока обесцвечивается. Отрицательная реакция характеризуется синей окраской всего молока в пробирке и слегка желтоватым слоем сливок.

Постановка РА методом адсорбции антител {по Кастеллани). У отдельных видов микробов наряду со специфическими видовыми антигенами имеются групповые, общие с другими видами одного рода или семейства бактерий. При введении в организм животного (и человека) таких бактерий (например, сальмонелл) образуются антитела против как видоспецифических, так и групповых (общих разным видам) антигенов. Если в реакции участвует микроб, обладающий групповым и типовым антигенами, то происходит полная агглютинация общих (групповых) и типоспецифических антигенов, при этом из сыворотки все антитела адсорбируются. Если антиген не типоспецифичен антителам, то происходит реакция агглютинации за счет групповых антигенов и групповых антител, типоспецифические антитела в сыворотке остаются.

Адсорбированные групповые антитела удаляют, сыворотки с групповым агглютинатом центрифугируют, а надосадочную жидкость (сыворотку с оставшимися типоспецифическнми антителами) отсасывают и вновь используют в РА. Так как сыворотка, истощенная групповыми антигенами, содержит только специфические антитела, она будет реагировать положительно лишь со специфическим антигеном. На этом принципе основан метод получения монорецепторных сывороток.

Реакция Кумбса. В ряде случаев при постановке РА не отмечают выпадения агглютината. Одной из причин этого является наличие в сыворотке больных животных наряду с полными антителами так называемых неполных или блокирующих антител, которые тормозят образование агглютината (выпадение комплекса антиген—антитело в виде осадка). Методика выявления неполных антител в организме больного разработана Кумбсом.

Прямая реакция Кумбса заключается в том, что к эритроцитам больного животного добавляют специфическую антиглобулиновую сыворотку (содержащую антитела против глобулинов сыворотки). Эритроциты агглютинируют. При непрямой реакции исследуют сыворотку больного животного, которую соединяют с эритроцитами здорового животного. Затем, как и при использовании прямого метода, добавляют антиглобулиновую сыворотку. Блокирующие (неполные) антитела соединяются с эритроцитами, и добавленная антиглобулино- вая сыворотка, вступая в реакцию с неполными антителами, приводит к агглютинации эритроцитов, нагруженных неполными антителами (рис. 9.12).

Реакция Кумбса (схема)

Рис. 9.12. Реакция Кумбса (схема)

Для диагностических целей в ветеринарии разработана удобная модификация методики реакции Кумбса — бактерийный вариант, в котором вместо эритроцитов применяют специфический бактерийный антиген.

Бактерийный вариант реакции Кумбса. С исследуемыми сыворотками ставят обычную РА. После учета результата реакции в пробирки, в которых отсутствует агглютинация, добавляют по 2 мл физраствора и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин. Надосадоч- ную жидкость удаляют, к осадку добавляют 1 мл антиглобулиновой сыворотки в рабочем титре (установленный предварительно). Центрифужные пробирки встряхивают, содержимое переносят в агглюти- 158

национные пробирки, ставят их в термостат (температура — 37—38 °С) на 16—48 ч, а затем выдерживают еще 1 ч при комнатной температуре. Учет производят по характеру агглютината, как при использовании обычного метода РА. Реакция Кумбса очень чувствительна и позволяет наиболее точно выявлять больных.

 
Посмотреть оригинал
Если Вы заметили ошибку в тексте выделите слово и нажмите Shift + Enter
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >
 

Популярные страницы