Меню
Главная
Авторизация/Регистрация
 
Главная arrow Агропромышленность arrow Ветеринарная иммунология (теория и практика)

Реакция связывания комплемента (РСК)

В основу реакции легли два явления — бактерилиза и гемолиза. В их проявлении участвует комплемент. Поэтому в РСК применяют две системы компонентов: одна обеспечивает феномен бактериолиза и используется для диагностических целей, другая — гемолитическая, индикаторная, вспомогательная, позволяющая установить, связался или не связался комплемент в первой системе. Ранее в качестве антигена брали взвесь бактерий, поэтому первая система была названа бактериолитической (в положительных случаях происходил лизис бактерий).

РСК осуществляют в два этапа. Сначала готовят бактериолитичес- кую систему — в пробирках смешивают по 0,5 мл исследуемой сыворотки и антигена, добавляют комплемент в строго определенной дозе (титре). Смесь антиген—сыворотка—комплемент (бактериолитическая система) помещают в водяную баню (или термостат) и выдерживают при температуре 37—38 °С 20—40 мин. Результат взаимодействия компонентов в пробирке невидим, жидкость остается прозрачной и бесцветной. Чтобы определить, связался ли комплемент в бактериолитической системе, нужен второй этап реакции. В пробирки добавляют компоненты гемолитической системы — отмытые эритроциты барана и инактивированную гемолитическую сыворотку.

Все компоненты бактериолитической системы встряхивают для перемешивания в пробирке, помещают в водяную баню и выдерживают при температуре 37—38 °С 20—40 мин. Затем добавляют компоненты гемолитической системы, вторично все встряхивают и вновь помещают в водяную баню на 10—15 мин.

Предварительный учет результата: если сыворотка от больного животного, то в ней содержатся антитела, которые соединяются со специфическим антигеном. С этим комплексом (антиген—антитело) связывается комплемент—гемолиза не будет, результат положительный.

Если сыворотка от здорового животного, она антител не содержит, комплекса антиген—антитело не образуется, комплемент в бакте- риолитической системе не свяжется. При добавлении эритроцитов и гемолизина (это между собой антиген и антитело) комплемент реагирует с этим комплексом — произойдет гемолиз, результат отрицательный.

После этого пробирки оставляют при комнатной температуре на 15—20 ч и учитывают окончательный результат. Если в бактериолити- ческой системе сыворотка была от больного животного, то в пробирке образуется специфический комплекс антиген—антитело, который адсорбирует (связывает) весь добавленный комплемент. Следовательно, во второй, гемолитической, системе гемолиза не произойдет, эритроциты осядут на дно пробирки, надосадочная жидкость прозрачная — результат РСК положительный. Если в исследуемой сыворотке нет специфических антител к используемому антигену (в случаях, когда сыворотка от здорового животного), то в бактериолитической системе комплекс антиген—антитело не образуется и, следовательно, комплемент в данной системе не адсорбируется, он остается свободным в пробирке. При добавлении компонентов гемолитической системы (во второй фазе реакции) комплемент вступает во взаимодействие со вторым комплексом (гемолизин—эритроциты), происходит гемолиз — осадка эритроцитов не образуется, жидкость в пробирке лаково-красная. Результат: РСК отрицательный.

РСК используют:

  • 1) для обнаружения в сыворотке больного животного специфических антител (при диагностике бруцеллеза, перипневмонии, сапа, лептоспироза, трипаносомоза и др.);
  • 2) для выявления в исследуемом материале специфического антигена (бактериального или вирусного) при наличии специфической иммунной сыворотки.

Для постановки РСК необходимо иметь: пробы сывороток, поступившие для исследования; две сыворотки заведомо позитивные (стандартные, обеспечивающие положительный результат) и две — нормальные (все сыворотки в разведении 1:10 инактивируют при 56—58 °С 30 мин); антиген в разведении согласно титру; комплемент, разведенный в соответствии с установленным тигром при титрации в бактериолитической системе; гемолизин в рабочем титре; эритроциты барана 1:40; физиологический раствор; градуированные пипетки; пробирки; штативы; водяную баню, рассчитанную на 37—38 °С.

Перед постановкой РСК кровь барана дефибринируют, эритроциты отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования до полной прозрачности надосадочной жидкости, которую удаляют отсасыванием, а осажденные эритроциты разводят в физиологическом растворе 1:40 (2,5%). Антиген разводят согласно титру, указанному на 166

этикетке биофабрикой. Гемолизин и комплемент перед постановкой РСК титруют.

Антиген для РСК готовят на биофабриках. Обычно это экстракты разрушенных микробных взвесей (или вирусосодержащей ткани). Антигены не должны обладать гемолизирующим действием, что контролируется в процессе постановки реакции (в пробирку наливают 1—2 дозы антигена и 0,5 мл взвеси эритроцитов: гемолиза не должно быть). На ампуле с антигеном биофабрика указывает, что он предназначен специально для РСК (сапной, бруцеллезный или другой). На упаковочной коробке ставят номер серии, дату изготовления, срок годности, активность антигена, т.е. в каком разведении его надлежит использовать при постановке РСК (1:100,1:150ит.п.). При отдельных заболеваниях антигеном служат другие материалы. Например, для диагностики перипневмонии крупного рогатого скота антигеном для РСК служит лимфа теленка, экспериментально зараженного подкожно или интраплеврально. При длительном хранении антигенов их титр вновь проверяют в лаборатории по специальной схеме титрации.

Испытуемые сыворотки, поступившие для исследования, разводят физиологическим раствором 1:5 или 1:10, для разрушения собственного комплемента инактивируют прогреванием на водяной бане при температуре 56—58 °С (сыворотки ослов, мулов, лошаков — при 61 °С) 30 мин.

Гемолизин готовят на биофабриках путем гипериммунизации кроликов отмытыми эритроцитами барана. Для этого кроликам внутривенно 4—5 раз с 2—3-дневными интервалами вводят 40—50%-ю взвесь эритроцитов. Через неделю после последней инъекции у кроликов берут кровь, стерильно отсасывают сыворотку, инактивируют ее, консервируют глицерином 1:1 или 0,5%-м фенолом, титруют, разливают по ампулам. В лабораториях перед постановкой РСК вновь титруют.

Схема титрации гемолизина. Для данной реакции необходимо подготовить: 1) комплемент в разведении 1:20; 2) гемолизин в разведении 1:100 (0,2 мл гемолизина + 9,8 мл физраствора); 3) взвесь эритроцитов барана 1 : 40; 4) физиологический раствор NaCl.

Для постановки реакции титрации в штативе размещают два ряда пробирок — первый (вспомогательный) нужен для приготовления разведений гемолизина, второй — собственно для титрации. Только в первую пробирку вносят исходное разведение гемолизина 1 : 100, затем производят последовательное разведение (рис. 9.20).

Все пробирки встряхивают и помещают на водяную баню, выдерживая при 37—38 °С 10—15 мин.

Учет результата: в данном примере наименьшее количество (или его наибольшее разведение), давшее полный гемолиз, — 1: 2000; это фактический титр гемолизина. Рабочий титр в два раза концентрированнее — 1 : 1000.

Разведение и схема титрации гемолизина

Рис. 9.20. Разведение и схема титрации гемолизина:

ПГ — полный гемолиз; ЧГ — частичный гемолиз; НГ — нет гемолиза

Каждое разведение из пробирок первого ряда (по 0,5 мл) переносят в отдельные пробирки второго ряда (указано стрелками). Во все пробирки второго ряда добавляют по 0,5 мл комплемента, разведенного 1:20, по 0,5 мл эритроцитов барана (2,5%-ю взвесь, или в разведении 1:40) и по 1 мл физраствора, чтобы объем жидкости в каждой пробирке составил 2,5 мл (исходя из того, что в окончательной постановке РСК будут участвовать пять компонентов по 0,5 мл, которые составят объем 2,5 мл; на протяжении всей работы этот объем соблюдается).

Пробирки встряхивают и помещают на водяную баню на 10— 15 мин. Гемолиз прежде всего произойдет в пробирках с большим содержанием гемолизина (наименьшее его разведение — 1 : 500, 1 : 1000...). Наименьшее количество гемолизина (наибольшее его разведение), вызвавшее полный гемолиз эритроцитов в данных условиях, называется предельным (фактическим) титром гемолизина. Для дальнейшей работы гемолизин используют в два раза концентрированнее, т.е. в удвоенном количестве, удвоенном титре, который называют рабочим титром. Например, фактический титр — 1:2500 (или 1:2000), рабочий титр соответствует разведению 1:1250 (или 1:1000).

Комплемент открыт Бухнером (1889). Это составная часть свежей сыворотки, лимфы, тканевых жидкостей разных видов животных (и человека). У насекомых комплемент отсутствует. Комплемент — вещество белковой природы, сложной структуры. Он быстро инактивируется 168

при нагревании, длительном хранении, ультрафиолетовом облучении, сильном встряхивании, фильтрации через керамические фильтры, от добавления каолина, кислот, щелочей, алкоголя, ацетона, хлороформа, дистиллированной воды, взвеси бактерий и др. Комплемент можно консервировать, добавляя на 100 мл сыворотки, полученной от морской свинки, 5,0 г сернокислого натра, 4,0 г борной кислоты. Активность комплемента при этом сохраняется до полугода. Лучший способ консервирования — высушивание комплемента в условиях вакуума при низкой температуре (лиофилизация). В запаянных ампулах в таком состоянии он сохраняется два года. Перед каждой постановкой РСК активность комплемента проверяют титрованием, т.е. определяют его титр — оптимальное количество, необходимое для данной реакции. Комплемент титруют дважды — в гемолитической и бактериолитической системах.

Для титрации комплемента в гемолитической системе готовят компоненты: комплемент в разведении 1 : 20 (1 мл комплемента + + 19 мл физраствора), гемолизин, разведенный соответственно рабочему титру, взвесь отмытых эритроцитов барана (1 : 40), физраствор. В штатив ставят пробирки и разливают в них градуированной пипеткой разное количество комплемента с интервалом 0,03 мл (0,13; 0,16; 0,19; 0,22;...; 0,43 мл). Затем добавляют остальные компоненты, как указано на рис 9.21.

Титрация комплемента в гемолитической системе

Рис. 9.21. Титрация комплемента в гемолитической системе

Все пробирки встряхивают, помещают на водяную баню и выдерживают при температуре 37—38 °С Ю—15 мин, затем проводят учет результата (рис. 9.22).

Физиологический

Учет результата

Рис. 9.22. Учет результата:

НГ — нет гемолиза; ЧГ — частичный гемолиз; ПГ — полный гемолиз

Результат: наименьшее количество комплемента, обеспечившее полный гемолиз (в данном примере — 0,25 мл), принимают за титр комплемента.

Результат титрации начинают учитывать в пробирках с наибольшим содержанием комплемента, в которых прежде всего ожидается гемолиз. Наименьшее количество комплемента, обеспечившее полный гемолиз эритроцитов при данных условиях, называют титром комплемента в гемолитической системе.

Для титрования комплемента в бактериолитической системе необходимо иметь все компоненты реакции: комплемент в разведении 1:20, эритроциты в разведении 1:40, гемолизин в рабочем титре, две позитивные и две нормальные сыворотки, специфический антиген. Сыворотки разводят физраствором 1:10, инактивируют при 56—58 °С 30 мин. Каждую сыворотку по 0,5 мл разливают в два ряда пробирок. В пробирки каждого ряда добавляют комплемент в возрастающих количествах, как при титрации в гемолитической системе. Начинают с количества, принятого за титр в гемолитической системе, затем в каждой последующей пробирке дозу увеличивают на 0,03 мл, выравнивая объем до 0,5 мл физраствором.

После этого в один ряд пробирок с позитивной и нормальной сыворотками добавляют по 0,5 мл антигена, во второй ряд каждой сыворотки — по 0,5 мл физраствора. Все пробирки встряхивают и ставят на водяную баню на 30—40 мин. Затем во все пробирки вносят по 0,5 мл гемолизина и по 0,5 мл эритроцитов, встряхивают их и вторично помещают в водяную баню на 10-15 мин. Наименьшее количество комплемента, обеспечившее полный лизис эритроцитов в обоих рядах пробирок (с антигеном и без антигена) двух нормальных сывороток, в одном ряду (без антигена) каждой позитивной сыворотки и с полной задержкой (отсутствием) гемолиза в рядах позитивных сывороток с антигеном (в тех же дозах комплемента), называют титром комплемента, который используется в постановке главного опыта РСК при диагностических исследованиях.

Главный опыт РСК (собственно диагностическое исследование). В штативы ставят два ряда пробирок — по количеству исследуемых проб сывороток. Каждую инактивированную сыворотку наливают в две пробирки (по 0,5 мл), затем в одну добавляют антиген (0,5 мл), в другую (без антигена) — физраствор (0,5 мл). Добавив комплемент, составляют бактериолитическую систему, а затем добавляют гемолитическую.

Схема постановки главного опыта РСК (рис. 9.23). Необходимые компоненты: 1) исследуемая сыворотка, инактивированная, разведенная физраствором 1:10; 2) специфический антиген, разведенный согласно титру, указанному биофабрикой на этикетке упаковки; 3) комплемент в установленном титре; 4) гемолизин в рабочем титре; 5) взвесь по

отмытых эритроцитов барана (1:40); 6) физраствор NaCl. Исследуемые сыворотки разливают в два ряда пробирок. Для любого количества исследуемых сывороток в качестве контроля используют заведомо позитивную (дающую положительный результат) и нормальную (от здорового животного, дающую отрицательный результат) сыворотку.

Схема постановки главного опыта

Рис. 9.23. Схема постановки главного опыта

Пробирки с компонентами бактериолитической системы встряхивают, помещают на водяную баню на 20—40 мин (при температуре 37-38 °С).

Пробирки бактериолитической системы второго ряда без антигена встряхивают, помещают на водяную баню при тех же условиях (рис. 9.24).

Контроль без антигена

Рис. 9.24. Контроль без антигена

Затем во все пробирки первого и второго ряда добавляют компоненты гемолитической системы и вторично помещают на водяную баню на 10—15 мин (рис. 9.25).

Результат учета в гемолитической системе

Рис. 9.25. Результат учета в гемолитической системе

В пробирках второго ряда без антигена везде полный гемолиз.

Для получения окончательного результата пробирки оставляют при комнатной температуре на 18—24 ч. Во всех пробирках без антигена, причем неважно, от какого животного получена сыворотка — от больного или от здорового, должен быть гемолиз, в пробирках первого ряда с антигеном более четкий результат выражен при отстаивании.

Показания реакции в пробирках с испытуемыми сыворотками считают достоверными, если в пробирках с позитивными сыворотками и антигеном гемолиз отсутствует при полном гемолизе в пробирках с позитивной сывороткой без антигена и во всех пробирках с заведомо нормальной сывороткой.

Данная реакция должна сопровождаться контролями антигена, комплемента, гемолизина, эритроцитов. Для этого в отдельные пробирки наливают антиген с эритроцитами барана; комплементе эритроцитами без гемолизина; гемолизин с эритроцитами без комплемента; эритроциты и физраствор. Объем в каждой пробирке доводят физраствором до 2,5 мл. Пробирки встряхивают, помещают на водяную баню и выдерживают при температуре 37 °С 20 мин. Во всех контрольных пробирках гемолиза быть не должно.

Результат РСК принято выражать «в крестах»: + + + + (#) — полное осаждение эритроцитов (нет гемолиза), жидкость над осадком бесцветная; + + + (///) — жидкость над осадком едва заметно окрашена в желтоватый цвет — это показатели положительного результата реакции. Наличие осевших на дне эритроцитов и частичное окрашивание надосадочной жидкости за счет лизиса некоторой части эритроцитов обозначают + + — (++ ), т.е. два и два с половиной креста означает сомнительный результат реакции. Резко выраженный гемолиз (без осадка) или с небольшим осадком (+) — отрицательный результат.

Реакция длительного связывания комплемента (РДСК) более эффективна по чувствительности в отличие от обычной классической РСК. Суть реакции заключается в том, что бактериолитическую систему выдерживают при трех различных температурных режимах: после смешения компонентов — при комнатной температуре 15 мин, затем при низкой температуре (4 °С) в рефрижераторе 18—20 ч и на водяной бане 15 мин. После этого добавляют гемолитическую систему, встряхивают, вновь помещают на водяную баню и производят учет реакции, как обычно при РСК. Многими исследователями подтверждена эффективность РДСК при диагностике ряда инфекционных болезней (туберкулеза, вибриоза, бруцеллеза и др.).

Реакция подавления связывания комплемента (РПСК), или реакция торможения, — непрямая РСК. В данной реакции участвует еще один компонент — стандартная иммунная сыворотка, содержащая антитела к антигену, используемому обычно для диагностики, а следовательно, положительно реагирующая в классической РСК.

Исследуемую сыворотку смешивают с антигеном и некоторое время выдерживают без комплемента, затем добавляют комплемент и стандартную сыворотку, пробирки встряхивают и помещают на водяную баню на 20—30 мин, после чего добавляют гемолитическую систему и вновь ставят на водяную баню. Если нет гемолиза — результат отрицательный, потому что испытуемая сыворотка не реагировала с антигеном и последний вступил в реакцию со стандартной сывороткой, связав комплемент. Если исследуемая сыворотка получена от больного животного, то она содержит специфические антитела по отношению к антигену. Происходит реакция между антигеном и антителами без связывания комплемента. Антиген, занятый антителами исследуемой сыворотки, не вступает в реакцию (подавляется) со стандартной (заведомо известной специфической) сывороткой, комплемент остается свободным и вступает в реакцию в гемолитической системе — происходит гемолиз, результат реакции положительный по отношению к исследуемой сыворотке.

 
Посмотреть оригинал
Если Вы заметили ошибку в тексте выделите слово и нажмите Shift + Enter
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >
 

Популярные страницы