Меню
Главная
Авторизация/Регистрация
 
Главная arrow Агропромышленность arrow Ветеринарная иммунология (теория и практика)

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Классические методы определения бактерий, основанные на культивировании микроорганизмов с последующим микробиологическим и биохимическим анализом, являются трудоемкой и длительной процедурой с использованием дорогостоящего оборудования. Биосенсоры — аналитически чувствительная и недорогая альтернатива стандартным методам, применяемым сегодня для идентификации бактерий. Они представляют собой аналитические приборы, используемые для селективного определения веществ и организмов, в которых используется комбинация биологической системы узнавания и физического преобразователя. Увеличение количества анализируемых образцов, требующих проверки и контроля, и потребность в высокой чувствительности, скорости и точности аналитических измерений стимулировали значительный интерес к развитию биосенсоров как мощной и недорогой альтернативе по отношению к стандартным химическим и энзимологическим методам, используемым на сегодняшний день.

Для сбора информации и создания баз данных, используемых при идентификации микроорганизмов, они могут быть подвергнуты анализу на различном уровне. «Верхний» уровень — это геном и его копия в виде РНК. Нуклеиновые кислоты являются информационными макромолекулами, а это означает, что они характеризуются определенной последовательностью. Они являются своего рода «руководством» для клетки и управляют синтезом клеточных белков. Абсолютную идентификацию могло бы обеспечить определение полной последовательности нуклеотидов клеточного генетического материала. Это и было выполнено для Saccharomyces cerevisiae и большого количества бактерий. Однако проводить такое определение в целях идентификации, конечно, нецелесообразно. При этом возможность быстрой и эффективной идентификации предоставляет секвенирование (определение первичной структуры) специфических генов.

Для определения степени сходства последовательностей оснований ДНКразличных микроорганизмов может быть проведено разделение молекулы ДНК на одиночные цепи с последующей их гибридизацией с одноцепочечными участками Д Н К из других микроорганизмов. Это 180

позволяет непосредственно определить степень родства при отсутствии информации о структуре самой последовательности. Гибридизация ДНК создает базу для общепринятого определения видов в систематике бактерий. При проведении этого анализа штаммы одного и того же вида будут гибридизировать более чем на 70%. Подобную методику можно использовать для сравнения ДНК и РНК. Начиная с 1980-х гг. методы гибридизации внесли важный вклад в таксономию микроорганизмов, положив начало развитию генетического зондирования. ДНК-зонды представляют собой уникальные последовательности нуклеотидов, которые гибридизируются только с данным специфическим геном или генами. ДНК-зонды используются как точный способ идентификации микроорганизмов.

Наконец, революцию в использовании нуклеиновых кислот для генетического анализа произвела цепная реакция полимеразы (ЦРП), описанная выше — в гл. 9. Она легла в основу многих методов идентификации, фактически обеспечив специфичность подхода самой своей природой. Генетическая информация экспрессируется в виде белков. Определение аминокислотной последовательности является дорогостоящей и требующей продолжительного времени процедурой, применять которую для проведения ускоренной идентификации нецелесообразно. Наоборот, электрофорез, т.е. определение способности белковых молекул мигрировать под влиянием электрического поля через гель, — широко распространенный метод решения проблем таксономии и идентификации. Как способ идентификации может быть использован также электрофорез экстракта всех белков микроорганизма, который может считаться эффективным с точки зрения расхода проб, несмотря на то что он недостаточно быстр. Важным инструментом диагностики являются иммунологические методы, часто ориентированные на белки.

Общий состав клетки может быть проанализирован разными методами, которые применяются к целым клеткам или к отдельным клеточным экстрактам. Например, профиль внутриклеточных и мембранных липидов может быть получен методом газовой хроматографии (ГХ). Целые клетки могут быть подвергнуты пиролизу, а продукты их распада определены с помощью масс-спектрометрии (МС), используемой для изучения физико-химический свойств веществ микроорганизмов. Наконец, после исследования ряда физических методов на предмет их применения для характеристики микроорганизмов было установлено, что особенно ценной является инфракрасная спектроскопия Фурье (FT-IR, Fourier transform-infrared spectroscopy), которая совершенствуется и используется в современной биологии.

Большинство обычных методов идентификации основано на морфологии и физиологии. С помощью имеющихся наборов, применяемых для микробиологических анализов, определяется наличие или отсутствие тех или иных ферментов или использование тех или иных путей метаболизма. Для обеспечения ускоренной идентификации неизвестных культур с использованием этого подхода могут быть созданы специализированные компьютеризированные базы данных.

Хроматографические методы используют для идентификации бактерий и установления их систематического положения. Объекты исследований — жирные кислоты клеточной стенки, уникальные интермедиаты и конечные метаболиты жизнедеятельности бактерий. Хроматографические системы обычно сопрягают с компьютерами, что значительно упрощает учет результатов. Наиболее распространена идентификация жирных короткоцепочечных и тейхоевых кислот методом газожидкостной хроматографии. Жидкостной хроматографией под высоким давлением идентифицируют миколевую кислоту в клеточных стенках микобактерий. Тонкослойную хроматографию используют для идентификации изопреноидных хинонов клеточной стенки бактерий. У различных родов бактерий их содержание и набор различны, но постоянны, что позволяет установить систематическое положение каждого конкретного вида микроорганизма.

Наборы мультимикротестов — пластиковые планшеты, в лунки которых помещены различные субстраты и индикаторы. В лунки вносят различные разведения бактерий и проводят инкубацию при 37 °С. На практике используют тесты RapI D N Н для идентификации иерсиний и гемофилов, тесты RapID Е — идентификация для энтеробактерий и др., позволяющие получить результаты не позднее 4—8 ч.

Экспресс-диагностика. Иммунологические знания и методы используются практически во всех разделах биологии, ветеринарии и медицины от фундаментальных молекулярно-биологических исследовании до множества других сугубо практических процедур, осуществляемых растениеводами, животноводами и медиками.

Основные объективные требования к экспрессным методам идентификации микроорганизмов:

  • 1) получение результатов анализа в максимально короткие сроки;
  • 2) проведение и завершение анализа без выделения микроорганизма в чистой культуре, при использовании только нативного материала, в крайнем случае с привлечением элективных биосред для быстрого накопления возбудителей;
  • 3) высокая специфичность и высокая чувствительность;
  • 4) высокая производительность, простота, доступность и воспроизводимость анализов.

Какому из существующих методов экспресс-диагностики отдать предпочтение, зависит от многих конкретных условий. Однако наиболее оптимальным является использование 2—3 методов. Этот подход увеличивает надежность получаемого результата.

1. Энзимоиндикационное направление. Методы связаны с экспресс- индикацией биохимических свойств микроорганизмов и определением их ферментативного спектра.

Сложные поликомпонентные питательные системы необходимы ввиду разнообразных биохимических и энергетических потребностей микроорганизмов. Проявлению жизнедеятельности и биохимической активности патогенных и других микробов в средах способствует создание оптимальных условий для их роста и размножения и одновременное введение ферментируемых субстратов (углеводов, многоатомных спиртов, аминокислот и др.) с наиболее чувствительными индикаторами, которые бы регистрировали их ферментацию. Применение оптимальных полисубстратных сред способствует выделению и накоплению чистой культуры микробов с одновременным определением их биохимических признаков.

Сущность энзимоиндикационных методов состоит в том, что субстрат с индикатором отделен от питательной среды и фиксирован на специальном носителе. Имеются углеводно-бумажные диски с защитной пленкой (бумажные реагенты для определения дезаминаз у микробов) и их аналоги БИС (бумажно-индикаторные системы), углеводно-бумажные поплавки, углеводно-полимерные пленки. Они позволяют в течение кратчайшего срока (3—5 ч) определять ферментативную активность различных видов микроорганизмов.

Автономный препарат — это карандаш-фермент. Он позволяет без применения питательных сред непосредственно на предметном стекле определять биохимические свойства микробов.

Полисубстратная тест-система и энзимоиндикаторная лента позволяют одновременно идентифицировать у микробов до 20 биохимических признаков.

Электрофизический метод служит для определения ферментативной активности микроорганизмов. Метод включает посев микробной культуры на питательные среды, содержащие пептонную воду, различные углеводы, многоатомные спирты, аминокислоты с последующим ферментативным расщеплением исследуемых веществ. Процесс сопровождается образованием различных ионизированных продуктов распада, обнаруживаемых с помощью специальной электронной аппаратуры. Энзимоиндикация отличается высокой скоростью: регистрация проиходит через 45—60 мин с момента посева материала. С помощью этого метода можно обнаружить и идентифицировать конечные продукты распада, конечные мотаболиты, определив их биохимическую природу.

2. Иммунологическое направление позволяет определить как отдельные специфические детерминанты, так и антигенные группы и комплексы, характеризующие роды, виды и серовары бактерий. К иммунологическим экспресс-методам относят: реакции преципитации в жидкости по Асколи и в геле по Оухтерлони и Манчини (особенно их микроварианты).

Рапид-системы являются перспективными в целях одновременной и быстрой индикации различных видов микроорганизмов в реакциях микроагглютинации. При комплексировании иммунологических методов с физическими и химическими представляется возможной дифференциация иммунологического направления на ряд самостоятельных направлений, которые приведены ниже.

3. Иммунофизическое направление использует различные по природе и величине виды мелкодисперсных носителей (сорбентов) антигенов и антител. Это способствует повышению чувствительности комплексных иммунологических методов.

Реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) связаны с использованием эритроцитарных диагностических препаратов. Эритроцитарную диагностику применяют для ускоренного обнаружения и идентификации микроорганизмов (например, возбудителей туляремии, бруцеллеза, сальмонеллеза и др.) в различных биологических материалах и объектах внешней среды. Реакции с эритроцитарными диагностикумами весьма чувствительны и часто по чувствительности превосходят иные серологические реакции.

Разрабатывают реакции с применением цветных целлюлозных частиц в качестве носителей антигенов и антител. Преимущества таких препаратов: 1) отсутствие собственной антигенности; 2) стабильность при длительном хранении; 3) демонстративность и простота техники постановки реакции (обычно на предметном стекле); 4) высокая скорость прохождения реакции; 5) экономичность.

4. Иммунохимическое направление использует разнообразные комплексные соединения специфических антител или антигенов с химическими веществами. Химические вещества придают антигенам и антителам новые феноменологические способности и свойства, тем самым расширяя возможности экспресс-индикации микробных агентов, в частности лабораторного анализа вообще.

Практическую значимость приобрели методы иммунофлуоресцен- тного анализа (прямой, непрямой, антикомплементарный), которые ныне официально используются как методы экспрессной индикации и быстрого определения микроорганизмов.

  • 5. Иммуноферментное направление интенсивно развивается. В последние годы разработаны прямой, непрямой, антикомплементарный и другие методы быстрого обнаружения микробов, использующие иммуноэнзимологический принцип. Разработчиками предложены новые виды ферментов, а также разнообразные виды хромогенных субстратов.
  • 6. Иммуноэлектрофоретическое направление. Для целей экспресс- индикации микробов чаще прибегают к встречному иммуноэлектрофорезу. Использование новых химических красителей, ферментной или радиоактивной метки позволит резко повысить чувствительность метода иммуноэлектропреципитации.
  • 7. Иммунорадиологическое направление связано с применением разнообразных конъюгатов специфических антител или антигенов, соединенных с радиоактивными веществами, которые придают им новые феноменологические свойства и способности, расширяя возможности экспресс-индикационного метода. Перспективно развитие иммунорадиологического направления, так как оно несомненно приведет к созданию новых, простых методов экспресс-индикации микроорганизмов.
  • 8. Микроцитологическое направление цитоморфологического анализа связано с использованием светлопольной, фазово-контрастной, люминесцентной микроскопии бактериологических мазковых препаратов, обработанных и окрашенных красителями, позволяющими быстро идентифицировать микроорганизмы по морфологии и специфическим структурным элементам их микробной клетки.
  • 9. Бактериологическое направление основано на использовании оптимальных ростовых питательных сред, содержащих специфические биостимуляторы, для ускоренного получения бактериальной культуры и частичной идентификации микроорганизмов по совокупности культуральных признаков.
  • 10. Фагодиагностическое направление предусматривает идентификацию микробов в различных объектах с помощью специфических индикаторных бактериофагов; обнаружение и индикацию специфических фагов в различных материалах с помощью индикаторных микробных культур. Оно позволяет значительно сократить сроки исследований и установить природу возбудителя даже в тех случаях, когда другими методами ввиду его изменчивости или загрязненности материала возбудитель остается нераспознанным.
  • 11. Биологическое направление связанно с изучением токсических и агрессивных свойств микроорганизмов. Методы реализуют на одноклеточных организмах, культурах клеток, куриных эмбрионах, а также на здоровых, а еще лучше специально подготовленных лабораторных животных. Эти методы менее точны по сравнению с другими.
  • 12. Физико-химическое направление связано с использованием быстрых и достаточно сложных по аппаратурному оформлению методов. Методы включают изучение бактериальных популяций и их экстрактов с помощью хроматографии (газожидкостной идр.), спектроскопии (инфракрасной, ультрафиолетовой идр.), атакже с помощьютемпературной и кислотной агрегации, коагуляции микробных суспензий и их токсинов.
  • 13. Рецепторное и генетическое направления позволяют быстро изолировать санитарно-показательные микроорганизмы. Методы только начинают развиваться. Например, с использованием целлюлозноглобулинового диагностикума быстро обнаруживают патогенного стафилококка путем гомологии неизвестных нуклеиновых кислот с известными нуклеиновыми кислотами.
  • 14. Комплексное направление основано на интеграции различных методов и принципов. Оно связано с разработкой и созданием индикаторных тест-систем, которые позволяют в течение короткого времени определить комплекс основных признаков патогена или санитарнопоказательного представителя, достаточных для его идентификации до рода, вида и даже типа.

Пути перспективного развития экспресс-индикации и экспресс- идентификации микроорганизмов на ближайшие годы:

  • 1) разработка и конструирование препаратов, способствующих ускорению и удешевлению исследований, повышению эффективности лабораторной диагностики инфекций и индикации патогенных и других микроорганизмов;
  • 2) разработка более чувствительных, простых методов лабораторного анализа;
  • 3) дальнейшая интеграция методов и видов исследований, имеющих разные принципы действия, лежащие в их основе;
  • 4) разработка современных методов регистрации и учета результатов экспресс-индикационных и лабораторных исследований;
  • 5) компьютеризация исследований.
 
Посмотреть оригинал
Если Вы заметили ошибку в тексте выделите слово и нажмите Shift + Enter
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >
 

Популярные страницы