Расчет параметров взаимодействия в системах ДНК-лиганд из данных спектрофотометрического титрования с помощью программ компьютерной оптимизации

При переходе от простой модели к сложным, учитывающим особенности связывания протяженного лиганда с ДНК, а также образование нескольких типов комплексов, число неизвестных параметров и, следовательно, неоднозначность их определения, увеличивается. Поэтому для корректного получения параметров связывания лигандов с ДНК следует анализировать большие массивы экспериментальных данных. Так, в случае спектрофотометрического исследования систем ДНК-лиганд проводятся измерения спектров поглощения в широком диапазоне длин волн и концентраций реагирующих компонентов [99].

Ранее Хартли была предложена программа оптимизации экспериментальных данных DALS [207], позволяющая получить равновесный состав смесей, константы комплексообразования и молярные коэффициенты экстинкции для систем, в которых выполняется закон действующих масс (ЗДМ). Для получения параметров связывания в системах ДНК - лиганд, для которых неприменим закон действующих масс, была разработана серия новых программ оптимизации (DALSPH, DALSMOD), основанных на уравнениях, описывающих процессы связывания лигандов с полиэлектролитными матрицами [99, 208].

На основании многочисленных экспериментальных данных было показано, что взаимодействие лигандов с полиэлектролитными матрицами может быть описано системой уравнений, учитывающих образование двух типов комплексов, одно из которых происходит кооперативно [99]. Также для катионных лигандов необходимо учитывать конкуренцию лиганда и ионов натрия при взаимодействии с фосфатными группами. Схематично эти процессы представлены на рис. 2.6.

Схематичное изображение процессов, происходящих при мультимодальном связывании лиганда с матрицей ДНК

Рис. 2.6. Схематичное изображение процессов, происходящих при мультимодальном связывании лиганда с матрицей ДНК: образование кооперативного комплекса (1 и Г) на месте связывания щ, образование некооперативного комплекса 2 на месте связывания п2, связывание ионов Na+ с фосфатами ДНК. Также в растворе присутствуют свободные ионы Na+, мономеры (ш) и димеры (d) лиганда.

Для описания процессов связывания, представленных на рис. 2.6, используются шесть уравнений (2.9) - (2.14) с шестью неизвестными: С/ No rNo Cft, ги у r2. Уравнения (2.9)-(2.11) описывают конкурентное связывание лиганда и иона Na+ с матрицей ДНК [199, 209]. Уравнения (2.10) - (2.11) тождественны уравнению МакГи и фон Хиппела для кооперативного связывания лиганда, а уравнение (2.12) описывает некооперативное связывание лиганда [173,199]. Уравнения (2.13) и (2.14) отражают закон сохранения общих концентраций ионов Na+ и лиганда. Равновесный состав каждого раствора лиганд-ДНК определяется при заданных общих концентрациях ионов Na+ (C/V„°), лиганда (CD°), нуклеотидов (С,,0) и пар нуклеотидов (CN°):

В уравнениях (2.9) - (2.14): KNa - макроскопическая константа связывания ионов Na+ с фосфатами ДНК на месте связывания nNc, = 1; к| - микроскопическая константа мономерного связывания лиганда

(комплекс 1) на месте связывания пу, со - фактор кооперативности, характеризующий образование агрегатов на тех же местах связывания; к2 - микроскопическая константа связывания лиганда на месте связывания п2 (комплекс 2); rNci и г — доли связанных ионов Na+ и комплекса 1, равные частному от деления соответствующих равновесных концентраций на С,,0; г2 - доля комплекса 2, равная частному от деления соответствующей равновесной концентрации на

CN°; Cf Na и Cfl - концентрации свободных ионов Na+ и мономера лиганда; KD - макроскопическая константа димеризации лиганда. Величина у характеризует вероятность расположения лигандов на соседних местах связывания и задается уравнением (2.11) [199].

Оптимальные значения молярных коэффициентов экстинкции образующихся комплексов и соответствующие константы связывания вычисляются путем минимизации суммы квадратов отклонений наблюдаемых оптических плотностей YAij (в /-ом растворе при у-ой длине волны) от расчетных, вычисляемых по закону Ламберта - Вера

как Соответствие полученных результатов

экспериментальным данным определяется путем сравнения фактора Гамильтона Q с предельным значением фактора Гамильтона Q/im, которые рассчитываются при каждом выходе из программ оптимизации по следующим уравнениям:

где Ау° и Ajj - наблюдаемые и вычисленные по закону Ламберта - Вера поглощения, а - отклонение в поглощении /-го раствора при j-ой длине волны, вычисленное с учетом погрешности всех экспериментальных величин.

Процесс оптимизации проводится на одной базе данных при разных фиксированных значениях nh п2 и со. Оптимальными считаются такие величины параметров связывания и молярных коэффициентов экстинкции для разных типов комплексов, при которых Q < Qylm и значение Q минимально. Описанная расчетная процедура реализована в программе оптимизации спектрофотометрических концентрационных зависимостей DALSMOD [99].

Система уравнений (2.9-2.14) также может быть модифицирована для описания конкурентного связывания в тройных системах лиганд 1 - лиганд2 - ДНК.

Для примера на рис. 2.7 приведены результаты оптимизации спектрофотометрического эксперимента в системе производное

Рис. 2.7. Молярные коэффициенты экстинкции для различных типов комплексов (а), зависимости относительных равновесных

актиноцина - ДНК, в которой реализуются мультимодальное и кооперативное связывание [210].

концентраций этих типов

комплексов от относительной концентрации ДНК (P/D) (б),

изотерма связывания, построенная в координатах Скетчарда (в),

рассчитанные при оптимальных значениях к2, к2, nh и п2.

Обозначения: кооперативное

связывание в форме мономера (1) и агрегата (Г) некооперативный комплекс 2, свободный лиганд (m+d) (3).

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >