Применение ИК-спектроскопии для анализа белков

В последние 15 лет ИК-спектроскопия зарекомендовала себя как один из основных методов структурного анализа компонентов биологических объектов, в том числе белков. Однако методология количественного определения белков развита существенно слабее, что не позволяет решать многие медико-биологические исследовательские задачи и проводить определение белков в сложных смесях. В настоящей работе исследована возможность количественного определения ряда белков в тонких водных, а также твердых пленках на подложке из фторида кальция.

Для работы с твердыми пленками белков в качестве подложки использовали пластины из фторида кальция. Новизна подхода заключалась в использовании чистых пленок белков в отсутствие полимеров, ПАВ и других структурообразующих агентов. Для построения градуировок использовали основные характеристические полосы поглощения белков: Амид I (1543 см-1) и Амид II (1655 см-1), а также еще четыре полосы поглощения, ранее не использованные для определения белков. Исследовали цитохром с, бычий и человеческий сывороточные альбумины. Образцы готовили нанесением капли раствора определенного объема на пластину с последующим высушиванием при различных условиях. Помимо воспроизводимости определения, внимание уделяли подбору условий, обеспечивающих определенное количество воды в образце, которое не мешало ИК определению и в то же время способствовало сохранению структуры белка. На основе дисперсионного анализа проведена оптимизация условий пробоподготовки, обеспечивающая максимальную чувствительность и воспроизводимость определения. Достигнуты пределы обнаружения всех исследованных белков на уровне субмикрограммовых концентраций (абсолютные количества белка на уровне долей микрограммов), при этом чувствительность определения хорошо коррелирует с числом формирующих сигнал групп в исследуемых белках. Относительное стандартное отклонение определения белков для диапазона концентраций 1-10 мг/мл не превышает 5 %. Предложенная методика определения белков отличается чувствительностью определения, большей чем существующие, а также простотой пробоподготовки.

Водные растворы белка в тонких пленках исследовали на примере человеческого и бычьего сывороточных альбуминов. Использовали тонкостенные кюветы с окнами из фторида кальция. В качестве растворителей использовали тяжелую воду 99,9 % и смесь D20 + Н20 с содержанием Н20 от 5 до 10%. Оптимизированы условия определения (длина оптического пути, объем аликвоты, полоса поглощения белка, условия пробоподготовки). Достигнуты пределы обнаружения на уровне 500 мкг/мл, что ниже как минимум на полпорядка, чем существующие данные. Относительное стандартное отклонение определения белков в диапазоне концентраций 5-20 мг/мл не превышает 3 %. Результаты исследования позволяют рекомендовать разработанную методику для количественного определения белков в биологических образцах.

Предложенные методики использованы при исследовании взаимодействия белков (гемопротеинов) с образованием липидных и других комплексов, при определении окисленных и восстановленных форм белков, а также протестированы на ряде реальных объектов.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >