Хроматографические методы в определении биологически активных веществ

Одновременное определение водо- и жирорастворимых витаминов методом жидкостной хроматографии

Большинство опубликованных работ по количественному анализу витаминов и их смесей методом ВЭЖХ посвящено раздельному определению двух разных групп - водо- и жирорастворимых витаминов. Это обусловлено большим различием хроматографических свойств витаминов этих групп. Водорастворимые витамины (ВВ) относительно слабо удерживаются неподвижной фазой и могут быть разделены в режиме обращенных фаз элюентами на основе буферных растворов с добавлением органического модификатора - ацетонитрила или метанола в количестве 5-30 % об. или буферными растворами, не содержащими органический растворитель. Для элюирования жирорастворимых витаминов (ЖВ), молекулы которых гидрофобны и имеют сильное сродство к модифицированной поверхности сорбента, необходима подвижная фаза на основе чистого органического растворителя или органического растворителя с небольшим содержанием воды, например 1 % об. воды в метаноле. ЖВ определяют как в обращенно-фазовом, так и нормально-фазовом режимах. Раздельное определение ВВ и ЖВ требует длительного времени и неудобно для серийного анализа продукции на производстве. При анализе ВВ происходит загрязнение колонки ЖВ, которые при соответствующих составах элюента остаются в неподвижной фазе. При таких условиях для получения воспроизводимых количественных результатов необходима дополнительная промывка колонки. В литературе описан другой способ решения этой проблемы. При анализе витаминного сиропа отделяют ЖВ методом твердофазной экстракции с использованием патронов, заполненных сорбентом С18. При пропускании раствора пробы в метаноле через патрон ЖВ переходят в слой сорбента, а ВВ остаются в растворе. ЖВ переводят в другой раствор промыванием патрона смесью ацетонитрил - тетрагидрофуран (1:1). Полученные растворы анализируют раздельно методом ВЭЖХ. Такой подход также длителен и трудоемок.

В связи с этим представляет научный и практический интерес разработка методики одновременного количественного определения В В и ЖВ в сложной смеси витаминов, например в витаминном сиропе.

В ходе работы использовали жидкостный хроматограф Waters Alliance 2695 с диодно-матричным детектором Waters 2996 с четырехкомпонентным градиентным смесителем на низком давлении. Разделение компонентов сиропа проводили на полимерных колонках размером 100x4,6 мм с монолитными сорбентами Chromolith Performance RP-8e и Chromolith Performance RP-18e. Для приготовления подвижных фаз использовали ультрачистую воду, ацетонитрил, изопропиловый спирт (ИПС), гексансульфонат и октансульфонат натрия квалификации «для жидкостной хроматографии» (Мерк, Германия).

Анализируемый сироп содержал витамины А (ретинола пальмитат, I), С (аскорбиновая кислота, II), В! (тиамина хлорид, III), В2 (рибофлавин- 5-фосфат, IV), В3 (кальция D-пантотенат, V), В6 (пиридоксина гидрохлорид, VI), Е (а-токоферол, VII), РР (никотинамид, VIII), консерванты нипагин (IX), нипазол (X), натрия бензоат (XI) и другие компоненты и вспомогательные вещества.

Хроматографическое разделение сложной смеси веществ, сильно различающихся по полярности и гидрофобности, возможно только в градиентном режиме. В связи с этим перспективно использование колонок нового типа Chromolith.

Для обеспечения оптимального удерживания компонентов основной природы (III, IV, VI) исследовали два подхода:

  • • повышение pH подвижной фазы до 6,0;
  • • введение ионпарного реагента в подвижную фазу с pH 3,0.

Варианты градиентного элюирования представлены в табл. 5.6.

Таблица 5.6

Варианты градиентного элюирования

Сорбент

Вариант

Изменение состава подвижных фаз

Chromolith

I

CH3CN:0,05 М КС104, pH 6,0 (0:1) 1:1 (к 4 мин) -? СН3СЫ:ИПС - 4:1 (8 мин)

Performance RP-8e

II

CH3CN:(0.05 М КС104, pH 3.0 + 2,5 % натрия гексансульфонат) (0:1) -> 15:85 (к 6 мин) -> СН3СЫ:ИПС = 4:1 (к 8 мин)

П1

CH3CN:(0.05 М КС104. pH 3.0 + 2.5 % натрия октансульфонат) (0:1) ^ 15:85 (к 6 мин) -> CH3CN:HIIC = 4:1 (к 8 мин)

Chromolith

IV

Состав (II)

Performance RP-18e

V

Состав (Ш)

Наилучшее разделение ВВ было получено при условиях варианта V. Для элюирования ЖВ на последнем этапе градиента была использована ПФ, содержащая только органические растворители. При этом пришлось столкнуться с проблемой возникновения пузырьков воздуха и потери потока подвижной фазы при переходе от водно-органического растворителя к 100 % объемн. ацетонитрила. Устойчивость потока подвижной фазы и бесперебойная работа хроматографа были обеспечены добавлением изопропилового спирта (соотношение CH3CN: ИПС = 4:1).

Хроматограммы анализируемого раствора при 210 (а), 267 (6), 246 (в) и 328 (г) нм

Рис. 5.12. Хроматограммы анализируемого раствора при 210 (а), 267 (6), 246 (в) и 328 (г) нм

Компоненты исследуемой смеси существенно различаются не только по хроматографическим, но и спектральным свойствам. Наиболее точные результаты анализа могут быть получены при детектировании каждого вещества в максимуме его поглощения. Такой подход неудобен, так как требует большого количества расчетов. Вместе с тем при анализе сложной многокомпонентной смеси измерение при одной длине волны также неприемлемо, поскольку не обеспечивает достаточную чувствительность и селективность определения компонентов с относительно низким содержанием или невысоким поглощением. На основании данных, полученных при помощи диодно-матричного детектора в процессе регистрации хроматограмм, было принято решение проводить детектирование при четырех длинах волн. Один из компонентов, определивших выбор длины волны 210 нм, - кальция D-пантотенат (V). Его спектр не имеет максимума: поглощение монотонно убывает с увеличением длины волны. При Я = 210 нм определяли также компоненты II, VI, VII - XI. Вещества I, III, IV детектировали при максимумах поглощения (328, 246, 267 нм соответственно). Хроматограммы испытуемого раствора представлены на рис. 5.12, где обозначены только те пики, площадь которых рассчитывали при соответствующей длине волны.

Разрешение «критической пары» - бензоата и нипагина - равно 1,1. Все остальные пики разделены до базовой линии (R > 1,5). Таким образом, полученное разделение позволяет провести селективное определение компонентов I - XI.

В табл. 5.7 приведены результаты анализа трех экспериментальных образцов сиропа и их метрологические характеристики.

Таблица 5.7

Результаты анализа трех опытных образцов витаминного сиропа

Компоненты

Норма, мг/мл

*ср

S

5L

Ср

Аскорбиновая кислота

10,8-20,2

21,570

0,532

0,177

0,410

21,369

0,661

0,220

0,509

20,785

0,720

0,240

0,554

Никотинамид

2,2-4,4

3,669

0,122

0,041

0,094

3,594

0,190

0,063

0,146

3,577

0,148

0,049

0,114

Тиамина хлорид

0,22-0,40

0,347

0,011

0,004

0,008

0,334

0,014

0,005

0,011

0,338

0,017

0,006

0,013

Рибофлавин-5 -фосфат

0,22-0,40

0,353

0,022

0,007

0,017

0,349

0,026

0,009

0,020

0,352

0,014

0,005

0,011

Кальция D-пантотенат

1,08-2,02

2,160

0,110

0,037

0,085

1,977

0,094

0,031

0,072

1,995

0,086

0,029

0,066

Пиридоксина гидрохлорид

0,27-0,51

0,472

0,021

0,007

0,016

0,447

0,032

0,011

0,025

0,452

0,024

0,008

0,018

Ретинола пальмитат

0,108-0,2025

0,223

0,012

0,004

0,009

0,193

0,013

0,004

0,010

0,174

0,011

0,004

0,008

Токоферола ацетат

1,08-2,025

2,148

0,123

0,041

0,095

1,982

0,121

0,040

0,093

1,800

0,114

0,038

0,088

Нипагин

0,68-0,82

0,771

0,032

0,011

0,025

0,692

0,044

0,015

0,034

0,702

0,041

0,014

0,032

Нипазол

0,22-0,28

0,286

0,018

0,006

0,014

0,240

0,016

0,005

0,012

0,240

0,013

0,004

0,010

Натрия бензоат

0,9-1,1

1,002

0,026

0,009

0,020

0,918

0,029

0,010

0,022

0,917

0,028

0,009

0,022

Для подтверждения достоверности результатов были приготовлены и проанализированы тест-растворы, содержащие все определяемые и вспомогательные (плацебо) вещества сиропа. Диапазон концентраций определяемых веществ в тест-растворах составил ±20 % от номинала. Обработка данных анализа тест-растворов по методу наименьших квадратов подтвердила, что в изученном диапазоне площади пиков определяемых компонентов и их концентрации связаны линейной зависимостью (Ккорр > 0,99).

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >