ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Метод ВЭЖХ -один из наиболее распространенных в аналитической химии СОЗ. В отличие от ГХ этот метод пригоден для определения термически неустойчивых, нелетучих или очень полярных загрязнителей. Он может быть применен для определения содержаний веществ, которые обычно обнаруживают методом высокоэффективной газовой хроматографии [34-37]. Начав развиваться с середины 60-х годов прошлого века, этот метод в первое время существенно проигрывал газовой хроматографии из-за отсутствия подходящих сорбентов для заполнения колонок. С появлением привитых фаз появилась возможность получения воспроизводимых результатов, что сделало ВЭЖХ идеальным инструментом для определения термически неустойчивых соединений. Большинство пестицидов, включая хлорпроизводные, ПАУ, относительно малолетучие хлорпарафины, фенолы, могут быть определены с помощью ВЭЖХ.

Для эффективного разделения определяемых веществ в ВЭЖХ применяют колонки из нержавеющей стали длиной 20-25 см и внутренним диаметром 4-5 мм, заполненные сферическими частицами силикагеля размером от 5 до 10 мкм с привитыми октаде- цильными группами [36,37]. Появление колонок меньшего диаметра, заполненных более мелкими частицами силикагеля, привело к уменьшению расхода растворителей и продолжительности анализа, увеличению эффективности разделения. К идеальным приближаются колонки с внутренним диаметром 1-2 мм, позволяющие разделять 100 пг пробы, содержащейся в 1 мкл раствора (т.е. при концентрации — 0,1 мкг/г). Эффективность таких колонок может достигать 100 000 теоретических тарелок, что сравнимо с эффективностью колонок в газовой хроматографии.

Колонки для ВЭЖХ довольно дорогие, их защищают от загрязнения, снабжая предохранительным картриджем (предколон- кой). Очень сложные смеси лучше предварительно разделять другими методами (например с помощью колоночной хроматографии), а при переходе от одного растворителя к другому следует избегать резких скачков их полярности. Растворы проб и растворители перед вводом в колонку необходимо отфильтровывать.

Большое значение в ВЭЖХ имеет выбор стационарной фазы. В общем случае прочность удерживания разделяемых веществ зависит от энергии адсорбции молекул растворителя и растворенных веществ. Чем она больше, тем прочнее удерживаются соединения в колонке. Значения энергий адсорбции зависят от вида взаимодействий, определяемых природой поверхности адсорбента и адсорбирующихся веществ. Наиболее распространенные полярные адсорбенты - силикагели, целлюлоза, оксид алюминия. Их применяют для определения органических кислот, пестицидов, нитросоединений. Поскольку вода оказывает существенное влияние на свойства полярных адсорбентов из-за конкурентной сорбции, ее содержание поддерживают постоянным, не допуская длительного контакта асорбентов с атмосферным воздухом.

Максимальный эффект обращения полярности обращенно- фазовых адсорбентов достигается при «пришивке» алкильных групп. Свойства таких адсорбентов зависят не только от природы пришитых групп и удельной поверхности, но и от структуры привитого слоя. По этому признаку они делятся на три группы:

  • • с мономолекулярным слоем пришитых групп;
  • • с поверхностным полимерным слоем;
  • • с объемно-модифицированным слоем.

В ВЭЖХ наибольшее практическое применение получили адсорбенты первого типа с «щеточными» структурами пришитых групп, содержащими от 1 до 22 метиленовых звеньев. Так, колонки фирмы «Supelco» заполняют модифицированными октадецил-, октил-, метил-, дифенилсиликагелями с диаметром частиц от 3 до 5 мкм. Чаще применяют адсорбенты с октадецильными группами (ультрасфер, ультрапак, сферисорб и др.). При большой длине цепи алкильные группы изгибаются, заполняя неровности поверхности. Такие фазы приближаются по свойствам к жидким с тем преимуществом, что они не уносятся потоком растворителя. Модифицирование дифенильными группами повышает селективность неподвижной фазы по отношению к ароматическим соединениям. Поскольку прочность удерживания разделяемых компонентов возрастает с увеличением длины алкильных радикалов, для разделения неполярных молекул большой массы применяют фазы с короткоцепными алкильными группами.

В качестве фаз с промежуточными свойствами применяют силикагели с пришитыми аминными, нитрильными и другими функциональными группами. Их фиксируют на поверхности адсорбента с помощью углеводородных цепочек из 10-11 метиленовых звеньев. При замене функциональных групп фазам можно придать ионообменные или комплексообразующие свойства, либо свойства хиральных лигандов, что позволяет разделять энантиомеры.

Выбор подвижной фазы, как правило, основывается на эмпирическом подборе индивидуальных растворителей или их смесей, имеющих необходимую элюирующую способность. Ее характеризуют способностью растворителей взаимодействовать с адсорбентом, что позволяет расположить их в элюотропный ряд (табл. 7.7). Для обращенно-фазовых адсорбентов эта последовательность обратная. Параметр е0 определяет скорость перемещения хроматографических зон, поэтому, выбрав соответствующий растворитель, можно регулировать время удерживания разделяемых компонентов

ТАБЛИЦА 7.7. Элюирующая способность растворителей 0) для оксида алюминия [2]

Растворитель

Растворитель

?0

Пентан

0,00

Метилэтилкетон

0,51

Изооктан

0,01

Ацетон

0,56

Декан

0,04

Этилацетат

0,58

Пентен

0,08

Анилин

0,62

ССЦ

0,18

Диэтиламин

0,63

Ксилол

0,26

Ацетонитрил

0,65

Изопропиловый эфир

0,28

Пиридин

0,71

Толуол

0,29

Пропиловый спирт

0,82

Бензол

0,32

Изопропиловый спирт

0,82

Этиловый эфир

0,38

Этиловый спирт

0,88

Хлороформ

0,40

Метиловый спирт

0,95

Т етрагидрофуран

0,45

Этиленгликоль

1,11

в колонке. Зная значения г0, можно варьировать состав смешанных растворителей, что дает возможность повысить селективность разделения и добиваться лучшего разрешения пиков. В частности, в обращенно-фазовой ВЭЖХ повышение содержания воды в смеси с ацетонитрилом или метанолом приводит к увеличению времени удерживания разделяемых веществ, поскольку время удерживания чистой воды соответствует максимальному удерживанию неполярных органических соединений. Элюирующая способность возрастает по мере увеличения доли менее полярного растворителя.

В ВЭЖХ применяют меньшее количество детекторов, чем в газовой хроматографии. Их можно разделить на оптические, электрические и электрохимические. Универсальным детектором является рефрактометрический детектор (РМД), принцип действия которого основан на измерении показателя преломления раствора, поступающего в детектор из колонки. Однако его невысокая чувствительность и селективность, а также несовместимость с градиентами давления привели к тому, что в большинстве последних моделей приборов этот детектор отсутствует.

Традиционный УФ-детектор с перестраиваемой длиной волны по существу представляет собой высокочувствительный УФ- спектрометр с проточной микроячейкой, который регистрирует оптическую плотность раствора при данной длине волны. В большинстве детекторов часть излучения направляется на второй фотодиод, расположенный в канале сравнения, для компенсации флук- 272

туаций в работе лампы. Для повышения чувствительности измерений монохроматор можно запрограммировать на автоматическое изменение длины волны в ходе анализа. Однако во всех случаях в данный момент времени измерение поглощения раствора осуществляется только в одной точке спектра. На практике часто бывает необходимо проводить измерения на различных длинах волн одновременно, когда определяемые вещества плохо разделяются хроматографически. Высокочувствительная запись спектров стала реальностью с появлением детекторов на диодной матрице. В таких детекторах матрица фотодиодов (более двухсот) постоянно регистрирует сигналы в ультрафиолетовой и видимой частях спектра, обеспечивая его запись в режиме сканирования. Данные, полученные одновременно на различных длинах волн, обрабатывают на компьютере, который выделяет сигнал на оптимальной длине волны, вычитает фон и осуществляет другие операции. Программное обеспечение может быть использовано для автоматической сверки УФ-спектров с известными, для идентификации компонентов и проверки «чистоты» пиков. Применение детекторов на диодной матрице обеспечивает получение аналитических данных с гораздо большей степенью достоверности. Этот детектор незаменим при определении очень низких концентраций пестицидов, фенолов, ПАУ и других СОЗ [22].

Действие флуоресцентного детектора (ФЛД) основано на измерении не поглощения, а испускания света. Большая популярность флуоресцентного детектора в ВЭЖХ объясняется его высокой селективностью и чувствительностью, и тем фактором, что многие вещества (например ПАУ) флуоресцируют при возбуждении. Посредством выбора длин волн возбуждения и испускания, зависящих от природы определяемого соединения, можно подобрать оптимальные условия детектирования для каждого отдельного вещества во время разделения. При этом флуоресцентный сигнал обеспечивает гораздо более высокую чувствительность по сравнению с УФ-детектором. Так, отклик ФЛД линеен для большинства ПАУ в диапазоне от 0,1 до 10 нг при введении в колонку пробы объемом 200 мкл, а предел обнаружения в воде составляет 0,005 нг/л (для УФ-детектора предел обнаружения в 100 раз выше).

Технологические усовершенствования коснулись и электрохимических детекторов (ЭХД) для ВЭЖХ. Ограничения, связанные с очисткой поверхности электродов от загрязнений и воспроизводимостью измерений, были сняты с появлением самоочищающихся электродов, и ЭХД нашли широкое применение для определения веществ, которые легко окисляются или восстанавливаются (фенолы, нитросоединения, галогенпроизводные, альдегиды и др.) [5]. В частности, с помощью ЭХД можно определять фенолы непосредственно в воде, минуя стадию экстракции.

Масс-спектрометрический детектор (МСД) в ВЭЖХ применяют редко, поскольку для соединения масс-спектрометра с жидкостным хроматографом требуется специальный интерфейс. Это обстоятельство ограничивает широкое применение комбинации ВЭЖХ-МС в аналитической химии.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >