НАРУШЕНИЕ ПАТТЕРНОВ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ КЛЕТОК HELA ПО СУБСТРАТУ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НИЗКОЧАСТОТНОГО ИМПУЛЬСНОГО ЭМИ (15 ГЦ)

К.Г. БУНИН', Н.Н. ОМЕЛЬЧУК", Ю.Г. СИМАКОВ***

*МПО «КАМЕНА», М. «Пушкинская», Петровский пер. дом 1/30, оф.№3, г. Москва, Россияб 107031 **Российский Университет Дружбы Народов, ул. Миклухо-Маклая, д. 6, к. 403, Москва, Россия, 117198 *’*Московский государственный университет технологий и управления им. К.Г.Разумовского, у л. Земляной Вал, 73, Москва, Россия, 109004

Аннотация. Эксперимент проведен на линии клеток HeLa, которая является одной из самых известных среди исследователей биологов и медиков, она широко используется в лабораториях для выявления факторов, подавляющих злокачественный рост, а также для испытания и тестирования различных лекарственных веществ. Показано, что после 60 минутного воздействия полем ЭМИ с частотой 15 Гц.от импульсного волнового аппарата «Камена» в культуре раковых клеток происходят морфологические структурные перестройки. Клетки HeLa сжимаются, у них уменьшается контакт с субстратом, а форма становится вытянутой и клинообразной. Помимо этого, под влиянием воздействия импульсным ЭМИ с частотой 15 Гц паттерны (узоры), образованные клетками HeLa, напоминающие «цветок», разрушаются, и клетки хаотично размешаются в культуре. Клетки HeLa, после воздействия полем аппарата «Камены», становятся разно размерными, что позволяет говорить о развитии анизоцитоза, который указывает на понижение устойчивости раковых клеток в культуре к неблагоприятным для них факторам. За этот же период времени в контроле (отсутствие воздействия импульсного ЭМИ) наблюдается только перемещение клеток HeLa относительно темной метки за счет горизонтальной миграции. При этом сжатия клеток и разрушение паттернов, которые первоначально отмечаются в культуре, в виде «цветка» не наблюдается. Выявленный эффект воздействия низкочастотного ЭМИ на морфологию раковых клеток и на паттерны их распределения по субстрату может оказаться важным для терапии злокачественных опухолей. Проведенный нами опытпока не позволяет ответить па вопрос, как долго сохраняется эффект воздействия на раковые клетки человека в культуре и насколько безопасно применение указанного импульсного поля ЭМИ для подавления активности злокачественных клеток.В наших экспериментах наблюдалось повышение клеточной пролиферации в культуре злокачественных клеток. Все это говорит о том, что необходимы дальнейшие исследования выявленного эффекта воздействия низкоинтепсивного импульсного ЭМИ на злокачественные клетки человека в культуре.

Ключевые слова: электромагнитное излучение, клетки HeLa, аппарат «Камена», модулированные импульсы.

VIOLATION OF THE PATTERNS OF DISTRIBUTION OF HELA CELLS ON THE SUBSTRATE DURING LOW- FREQUENCY PULSED ELECTROMAGNETIC RADIATION EFFECT (15 HZ)

K.G. BUNIN*, N.N. OMELCHUK**, YU.G. SIMAKOV***

* ICS "KAMENA", M. "Pushkinskaya", Peter Lane. House 1/30, of.№3, Moscow, Russia, 107031 *' Russian Peoples Friendship University, Str. Maclay, d. 6,. 403, Moscow, Russia, 117198 "'Moscow State K.G. Razumovsky University of Technologies and Management, Str. Ground Val, 73, Moscow, Russia, 109004

Abstract. The experiment was carried out on the cell line HeLa, which is one of the most famous among researchers, biologists and physicians; it is widely used in laboratories to identify factors that inhibit the cancerous growth, as well as for testing and testing of various drugs. It is shown that after 60 minutes of exposure field electromagnetic with a frequency of 15 Hz. from impulse wave of the device "Kamena" in the culture of cancer cells occurs morphological structural adjustment. HeLa cells are compressed and reduced contact with the substrate and form becomes elongated and wedge-shaped. In addition, under the influence of pulsed field electromagnetic with a frequency of 15 Hz patterns (patterns), formed by HeLa cells resembling a "flower", dissolved, and cells randomly appears in the culture. HeLa cells, after exposure to the field of apparatus "Kameny, become different dimension that allows to speak about the development of anisocytosis, which indicates a decrease in the resistance of cancer cells in culture for them to adverse factors. During the same time period in the control (without effects of pulsed EMR) is observed only move in HeLa cells relatively dark marks due to horizontal migration. This compression cells and destruction of patterns that originally marked in culture, in the form of the "flower", didn't observed. Revealed the effect of low-frequency field electromagnetic on the morphology of cancer cells and on the patterns of their distribution on the substrate may be important for therapy of malignant tumors. This experiment doesn't yet allow by the authors to answer the question: how long the effect on human cancer cells can be maintained in culture and how safe the use of this pulsed field EMR to inhibit the activity of malignant cells. In these experiments, the authors observed an increase in cell proliferation in culture of malignant cells. All of this suggests that further research of revealed effect of low-intensity pulsed electromagnetic radiation on malignant cells in culture is necessary.

Key words: electromagnetic radiation, the cells HeLa, apparatus "Kamena" modulated pulses.

Линия клеток HeLa была получена от чернокожей женщины Генриетты Лаке в 1951 году в США от больной карциномой шейки матки, которая вскоре умерла от рака, но культура ее клеток поддерживается в лабораториях мира до сих пор.

Клетки HeLa, как и все раковые клетки, бессмертны, в них синтезируется теломераза, которая способствует наращиванию теломеров, и эти клетки не подвержены феномену Хейфлика, когда здоровые клетки погибают после 52 делений [1,2].

За последнее время появился ряд сообщений о том, что низкочастотные электромагнитные излучения (ЭМИ) от 8 до 15 Гц подавляют прирост раковых клеток в культуре [3]. При использовании аппарата «Мини эксперт-ДТ» фирмы «ИМЕДИС» в течение 3 дней с интенсивностью 100 мкр Тесла, по 3 мин ежедневно, происходит подавление прироста раковых клеток в культуре на 25%. Идентичные исследования проведены с использованием различных культур раковых клеток при применении других аппаратов с воздействием поля частотой 8 Гц. В данном исследовании- выявлялось воздействие электромагнитного излучения с частотой 15 Гц, идущего от генератора «Камена» [4], на распределение и миграцию клеток HeLa но субстрату (дно пластикового матраца для культивирования). Частота ЭМИ 15 Гц., представляет собой одну из гармоник полей Шумана [5], которые служат основным резонатором для нормальных здоровых клеток большинства организмов на Земле. Выявление отклонений в паттернах распределения клеток по субстрату и их поведение при действии второй гармоники полей Шумана может иметь большое теоретическое и практическое значение, так как эти аномалии воздействуют непосредственно на процессы роста злокачественных опухолей и на образование метастазов в реальных злокачественных опухолях [7-91.

Цель исследования - выявить влияние низкоинтенсивных и низкочастотных импульсов ЭМИ на контакт клеток HeLa в культуре, а, следовательно, и на упорядоченное распределение по субстрату, а также на изменение в их площади контакта с субстра том.

Материалы и методы исследования. Матрасы с питательной средой и клетками HeLa, привитыми за 3 дня до постановки опыта, помещались дном непосредственно на аппарат «Камена» к контактным электродам.

Исследование проводилось с применением импульсноволнового генератора «Камена», который дает частот)' ЭМИ 15 Гц, представляющую собой вторую гармонику полей Шумана. Подаваемые импульсы на кварцевый кристалл генератора волн составляли 100 mV. Спектральная плотность колебаний составляет 0,1 мВ/м и обычно длится около 0,3 сек.

Размеры матраса для культивирования клеток 4,5x8,5 см. соответствовали размерам генератора волн. Экспозиция клеток HeLa в поле ЭМИ длилась 60 минут. Состояние культуры исследовалось и фотографировалось до начала воздействия аппарата и через 60 минут (прекращение воздействия аппарата). Клетки HeLa в культуре исследовались только в живом состоянии без применения фиксаторов и красителей с помощью инвертированного микроскопа. У исследователей уже имеется опыт прижизненного изучения оптической плотности клеток линии HeLa [6]. Воздействие поля аппарата осуществлялось через пластиковое дно матраца Кастора (сосуда для культивации клеток) толщиной 0,8 мм, к поверхности дна которого прикреплялись HeLa клетки.

Основными показателямибыли: измерение площади клеток, распластанных по субстрату, миграция клеток в свободные от культуры участки дна матраса и количество клеток, совершивших вертикальную миграцию, которые приобрели шаровидную форму, выклинились из монослоя и притупили к митозу. При этом они остались прикрепленными к распластанным по субстрату клеткам. Клетки HeLa, находящиеся в процессе деления, мы выявляли по округлым очертаниям и по оконтуриванию.

Для фотографирования одних и тех же зон на дне маграсас культурой клеток HeLa применяли прием естественных меток - темные образования и полосы характерной формы, так как через час (время воздействия генератора волн) положение клеток из-за миграции настолько менялось, что он не могли служить ориентиром. На изученных снимках участков культуры, ориентиром выступают либо черный эллипсоид и черная точка, либо характерное расположение клеток вокруг одной клетки в виде «цветка».

Прижизненное микроскопия культуры дает возможность подсчитать изменение средней площади отдельных клеток после воздействия сверхнизкими частотами ЭМИ. Помимо этого появляется возможность определить количество разрушенных паттернов распределения клеток по субстрату в виде «цветка», образованных клетками HeLa при биоконтакте между собой и при совершении горизонтальной миграции при заполнении пусгых окон на дне матраса. Наблюдение за состоянием клеток HeLa после воздействия полем аппарата «Камена» вели также через 24 и 72 часа.

В общей сложности было исследовано 5 флаконов для культивации клеток HeLa, в каждом из которых изучали клетки в 3-х полях зрения микроскопа при ув. 40x15, площадью 0,25 мм. В качестве контроля использовали три матраса с культурой, посеянной, как и для опыта, за 3 дня до начала эксперимента. Контрольные матрасы находились в отдалении от генератора электромагнитных волн.

Результаты и их обсуждение. Воздействие полем, полученным от генератора волн с частотой 15 Гц., приводит к изменению морфологии клеток HeLa, распластанных по поверхности дна матраса. В контроле происходит в основном сдвиг структур относительно метки, но паттерны клеточного распределения при этом сохраняются (рис. 1).

Контроль. А - до начала эксперимента; Б - тот же участок через 60 минут без воздействия «Камены»

Рис. 1. Контроль. А - до начала эксперимента; Б - тот же участок через 60 минут без воздействия «Камены»

При действии импульсного низкочастотного ЭМИ распределение клеток и их конфигурация меняется настолько, что все паттерны распределения клеток на отмеченном участке становятся неузнаваемыми. Все это указывает на активную горизонтальную миграцию клеток HeLa во время воздействия на них электромагнитным полем с частотой 15 Гц. Одновременно с этим часть клеток округляется, частично теряет адгезию с пластиковым дном матраса и приступает к делению. Один из таких сравнительных вариантов состояния участка культуры клеток HeLa до воздействия импульсами с частотой 15 Гц от аппарата «Каме- на» и после воздействия представлен па рис. 2.

Распределение клеток HeLa на отмеченном участке дна матра- сапод влиянием импульсного ЭМИ с частотой 15 Гц. а - до воздействия «Камены»; б - после воздействия аппарата «Камена»

Рис. 2. Распределение клеток HeLa на отмеченном участке дна матра- сапод влиянием импульсного ЭМИ с частотой 15 Гц. а - до воздействия «Камены»; б - после воздействия аппарата «Камена»

Справа показан тот же участок культуры клеток HeLa после воздействия полем аппарата «Камепа» в течение 60 минут.

В качестве ориентира-метки выступает темное пятно с левой стороны рассматриваемого участка дна матраса с культурой клеток HeLa.

На всех снимках в контроле отмечено своеобразное распределение клеток HeLa. Имеется одна центральная клетка, а вокруг нее располагается 8-10 вытянутых клеток. Все это как бы напоминает цветок. Как видно из рис. 2 а, после воздействия ЭМИ, идущего от генератора излучения, клетки HeLa сильно перемещаются и приобретают вытянутую клиновидную форму (рис. 2. б), пустые окна дна матраса резко сократились за счет горизонтальной миграции в них клеток HeLa. За счет вертикальной миграции, количество делящихся клеток, частично потерявших адгезию с субстратом, увеличилось в два раза по сравнению с контролем и культурой до применения генератора ЭМИ. Многие клетки находятся на стадии поздней телофазы, которая определяется по парам клеток с диаметром в два раза меньшим, чем клетки па остальных фазах митоза.

Исследование состояния клеток HeLa после воздействия волнового электронного импульсно-волнового аппарата «Камена» показывает, что поле аппарата вызывает разрушение основных структур клеток HeLa, похожих на «цветок». Скорее всего, это связно с сокращением контакта клеток с дном матраса за счет сжатия клеток и уменьшения их распластывания по субстрату.

Разрушение паттернов-«цветов» образованных на субстрате клетками НеБапод влиянием низкочастотного импульсного ЭМИ идущего от аппарата «Камена»

Рис. 3. Разрушение паттернов-«цветов» образованных на субстрате клетками НеБапод влиянием низкочастотного импульсного ЭМИ идущего от аппарата «Камена»: а - до воздействия; б - после воздействия

На рис. 3 а представлен также участок культуры клеток HeLa с крупной меткой внизу до воздействия импульсным волновым генератором ЭМИ В этом случае видны три структуры с центральной клеткой, напоминающие «цветок», а клетки достаточно распластаны по субстрату и готовы при заполнении пустот па дне также образовать структуры напоминающие «цветок». После воздействия низкочастотным импульсным полем ЭМИ в течение 60 минут мы видим совершенно другую картину этого же фрагмента клеточной культуры (рис. 3 б). Все три паттерна в виде «цветка» деструктированы, что говорит о резком возрастании хаотического распределения клеток HeLa по дну матраса. К тому же клетки резко сократили свою площадь и у них более четко проявились контуры, что указывает на повышение возрастания краев клеток над субстратом. У большинства клеток после воздействия низкочастотным импульсным генератором отмечается анизоцитоз.

Далее показан фрагмент газона культуры клеток Hela, где под меткой (черта под углом) расположена хорошо различимая структура в виде «цветка» (рис. 4.а), которая после воздействия импульсным волновым полем генератора «Камена» в течение часа также подвергается разрушению (рис. 4.6). Как и в других случаях, воздействие аппарата «Камена» приводит к сжатию клеток и к резкому возрастанию митозов (шаровидные клетки).

Разрушение отдельно взятого паттерна-«цветка» (в центре) под влияние импульсного поля «Камены»

Рис. 4. Разрушение отдельно взятого паттерна-«цветка» (в центре) под влияние импульсного поля «Камены»: а - до применения «Ка- мены»; б - после воздейст вия полем «Камены».

Изменение структурны у клеток HeLa при воздействии импульсным ЭМИ с частотой 15 Гц от аппарата «Камена» в течение 60 минут (площадь клетки в мкм2, паттерн-«цветок» - кол-во шт. на площади 0,25 мм2)

Показатели:

Наблюдение во время воздействия полем «Камены»

Наблюдение после воздействия поля «Камены»

30 мин.

60 мин.

24 часа

72 часа

Средняя площадь клетки (подсчет 1000 клеток, контроль)

1585±187

1614±155

15766±205

15694±185

Паперны- «цветки»(контроль) 10 полей зрения микроскопа

18

16

17

19

Средняя площадь клетки(подсчет 1000 клеток - опыт)

954*±126

Анизоцитоз

10126*±145

12341*±184

Паттерны- цветки» (опыт) 10 полей зрения микроскопа

12

3

5

12

Примечание: * - дост оверност ь разности средних площади клеток по критерию Стыодента; Р<0,05

Таким образом, только один морфологический анализ изменения структуры и контакта живых клеток HeLa под влиянием воздействия импульсио волнового генератора «Камепа», позволяет сделать вывод, что низкочастотные и низкоинтенсивные электромагнитные импульсы окончательно нарушают сохранившийся биоконтакт у злокачественных клеток, вызывают их сжатие, и повышают у них митотическую активность.

Для количественной оценки воздействия низкочастотных электромагнитных импульсов (15 Гц.) на увеличение хаотического распределения клеток HeLa по субстрату при культивировании нами были взяты - степень разрушения паттернов клеток в виде «цветка» и сокращение площади распластанных по стеклу клеток. Данные об этих показателях представлены в табл.

Таблица

Как видно из таблицы, происходит постепенное восстановление нарушенных воздействием поля «Камены» параметров, по к третьим суткам еще сохраняется достоверная разница между контролем и опытом.

Более длительное наблюдение за изменением площади клеток HeLa под воздействием импульсно-волнового ЭМИ затруднено, так какв процессе пролиферации клетки мигрируют из отмеченной исследуемой области.

Заключение. Показано, что после 60 минутного воз- действияполем ЭМИ от импульсного волнового аппарата

«Камена» в культуре раковых клеток происходят заметно видимые морфологические перестройки. Во-первых, клетки HeLa сжимаются и уменьшают контакт с субстратом, их форма становится вытянутой и клинообразной. Во-вторых, под влиянием воздействия импульсным ЭМИ с частотой 15 Гц паттерны (узоры), образованные клетками HeLa, напоминающие «цветок»,разрушаются, и клетки хаотично размещаются в культуре. Налицо развитие энтропии. Помимо отмеченных эффектов, клетки HeLa, после воздействия ЭМИ, становятся разноразмерными, что позволяет говорить о развитии апизоцитоза, который указывает па понижение жизненной активности раковых клеток в культуре.

За этот же период времени в контрольных культурах, не подвершутых воздействию импульсного ЭМИ, наблюдается только перемещение клеток HeLa относительно темной метки за счет горизонтальной миграции. Но сжатия клеток и разрушение паттернов в виде «цветка» не наблюдается.

Выявленный эффект воздействия низкочастотного ЭМИ па морфологию раковых клеток и на паттерны их распределения по субстрату может оказаться важным для терапии злокачественных опухолей. Проведенный нами краткосрочный опыт не позволяет пока ответить на вопрос, как долго сохраняется эффект воздействия на раковые клетки человека в культуре и насколько безопасно применение указанного импульсного поля ЭМИ в отношении повышение клеточной пролиферации в культуре злокачественных клеток, которое наблюдается в данных экспериментах. Только дальнейшие эксперименты позволят ответить на эти вопросы.

Литература

  • 1. Smith V. Wonder Woman. The Life, Death, and Life After Death of Henrietta Lacks, Unwitting Heroine of Modern Medical Science. Posted 4/17/2002.
  • 2. Фукуяма Ф. Наше постчеловеческое будущее: последствия биотехнологической революции. М.: «АСТ», 2004. С. 89-92.
  • 3. Подчерняева Р.Я., Лопатина О.А., Михайлова Г.Р., Бакланова О.В., Данлыбаева Г.А., Гущина Е.А. Влияние экзогенного частотного воздействия на клеточные линии человека // Клеточные технологии в биологии и медицине, 2008. № 3. С. 161-165.
  • 4. Симаков Ю.Г., Бунин К.Г. Изменение деления и адгезии у раковых клеток HeLa при воздействии низкочастотным ЭМИ // Инновации и инвестиции. 2014. №5. С. 209-212.
  • 5. Сподобаев Ю.М., Кубанов В.П. Основы электромагнитной экологию. М.: Радио и связь, 2000. 240 с.
  • 6. Петров Ю.П., Божокина Е.С., Цупкина И.В. Прижизненное изменение оптической плотности клеток линии HeLa // Цитология. 2013. Т.55. № 9. С .601-608.
  • 7. Кидалов В.Н., Хадарцев А.А. Тезиография крови и биологических жидкостей / Под ред. А.А. Хадарцева. Тула: Тульский полиграфист, 2009. 244 с.
  • 8. Хадарцев А.А., Еськов В.М., Хадарцев В.А., Иванов Д.В. Клеточные технологии с позиций синергетики // Вестник новых медицинских технологий. 2009. № 4. С. 7-9.
  • 9. Кидалов В.Н., Хадарцев А.А., Багаутдинов Ш.М., Че- чегкин А.В. Постоянство непостоянного в тезиограммах препаратов крови (к стандартизации исследований кристаллизации биологических жидкостей) // Вестник новых медицинских технологий. 2008. № 4. С. 7-13.

References

1. Smith V. Wonder Woman. The Life, Death, and Life After Death of Henrietta Lacks, Unwitting Heroine of Modern

Medical Science. Posted 4/17/2002.

  • 2. Fukuyama F. Nashe postchelovecheskoe budushchee: po-sledstviya biotekhnologicheskoy revolyutsii. Moscow: «AST»; 2004. Russian.
  • 3. Podchernyaeva RYa, Lopatina О A, Mikhaylova GR, Baklanova OV, Danlybaeva GA, Gushchina EA. Vliyanie ekzo- gennogo chastotnogo vozdeystviya na kletochnye linii chelove- ka. Kletochnye tekhnologii v biologii i meditsine. 2008;3:161-5. Russian.
  • 4. Simakov YuG, Bunin KG. Izmenenie deleniya i adgezii u rakovykh kletok HeLa pri vozdeystvii nizkochastotnym EMI. Innovatsii i investitsii. 2014;5:209-12. Russian.
  • 5. Spodobaev YuM, Kubanov VP. Osnovy elektromag- nitnoy ekologiyu. Moscow: Radio i svyaz'; 2000. Russian.
  • 6. Petrov YuP, Bozhokina ES, Tsupkina IV. Prizhiz- nennoe izmenenie opticheskoy plotnosti kletok linii HeLa. Tsi- tologiya. 2013;55(9):601-8. Russian.
  • 7. Kidalov VN, Khadartsev AA. Teziografiya krovi i bi- ologicheskikh zhidkostey / Pod red. A.A. Khadartseva. Tula: Tul'skiy poligrafist; 2009. Russian.
  • 8. Khadartsev AA, Es'kov VM, Khadartsev VA, Ivanov DV. Kletochnye tekhnologii s pozitsiy sinergetiki [Cell' technologies from synergy point of vien], Vestnik novykh medit- sinskikh tekhnologiy. 2009;4:7-9. Russian.
  • 9. Kidalov VN, Khadartsev AA, Bagautdinov ShM, Che- chetkin AV. Postoyanstvo nepostoyannogo v teziogrammakh preparatov krovi (k standartizatsii issledovaniy kristallizatsii biologicheskikh zhidkostey) [Constancy changeable in tesio- gramms preparations of blood (to standardization of researches of crystallization of blood)]. Vestnik novykh meditsinskikh tekhnologiy. 2008;4:7-13. Russian.

УДК: 612.1+612.17]:613.71-073.96 DOI: 10.12737/5891

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >