Меню
Главная
Авторизация/Регистрация
 
Главная arrow Техника arrow Аналитическая химия

Жидкостная хроматография

Согласно классификации хроматографических методов по агрегатному состоянию фаз все хроматографические методы, использующие в качестве подвижной фазы жидкость, относят к жидкостной хроматографии (ЖХ). В пределах этой большой группы методы классифицируют по механизму взаимодействия молекул сорбата с неподвижной фазой: адсорбционная, распределительная, ионообменная и эксклюзионная хроматография. Однако классификация видов хроматографии по механизму разделения достаточно условна, так как очень часто в реальном процессе параллельно протекают различные взаимодействия в зависимости от природы разделяемых веществ, подвижной и неподвижных фаз.

Благодаря ряду достоинств (универсальность, возможность автоматизации разделения и анализа сложных смесей органических и неорганических веществ, экспрессность, эффективность и высокая чувствительность) ЖХ в последние десятилетия получила все большее распространение. Методом ЖХ можно анализировать смеси практически всех растворимых веществ, в том числе и тех, которые не могут быть проанализированы методом газовой хроматографии из-за их высоких температур кипения или термолабильности. Разделение в ЖХ проводят при низких температурах (20—60 °С), что улучшает разделение. Для ЖХ характерна значительно более высокая эффективность разделения по сравнению с ГХ (число теоретических тарелок достигает сотен тысяч на 1 м колонки).

В классическом варианте ЖХ, берущей начало с основополагающей работы Цвета (1906 г.), частицы неподвижной фазы имеют диаметр от 100 мкм и выше. Жидкость по колонке передвигается за счет силы тяжести, отдельные фракции элюата собираются и затем анализируются. При этом скорость потока подвижной фазы составляла не более 1 мл/мин и разделение часто оказывалось слишком длительным.

Начиная с 60-х гг. прошлого века развивается вариант высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В этом варианте используются сорбенты с размером частиц 3—10 мкм. Из кинетической теории известно (уравнение Ван-Деемтера), что высота, эквивалентная теоретической тарелке, зависит от коэффициента сопротивления массопереноса (С), который, в свою очередь, прямо пропорционален квадрату размера частиц носителя. Уменьшение размеров зерен существенно уменьшает ВЭТТ и увеличивает эффективность колонки. Кроме того, применение узких колонок с внутренним диаметром 4—6 мм и высокая вязкость жидкой подвижной фазы по сравнению с газами вызвали необходимость повышения давления на входе в колонку до 15—400 МПа, чтобы увеличить скорость прохождения элюента.

Одновременно были разработаны детекторы, позволяющие определять до 10-10 г вещества: фотометрические (в УФ- и видимой областях), рефрактометрические, флуориметрические, амперометрические.

Большим достоинством ВЭЖХ является возможность использовать все механизмы разделения: адсорбционный, распределительный, ионообменный, эксклюзионный. Основные теоретические положения ВЭЖХ и классической колоночной ЖХ практически одинаковы.

Первым был использован адсорбционный механизм в форме жидкостно-твердофазной хроматографии. В настоящее время этот вид хроматографии используется для разделения неполярных веществ, пространственных изомеров, а также группового разделения, например, алифатических углеводородов и алифатических спиртов. Распределительный механизм лежит в основе жидкость-жидкостной хроматографии. Здесь наибольшее распространение получил вариант обращенно-фазовой хроматографии. В основе ионообменной хроматографии лежит явление ионного обмена. Эксклюзионная хроматография основана на молекулярно-ситовом эффекте, т.е. разделении молекул на пористом материале в соответствии с их размерами. Эти методы обычно называют гель-хроматографией.

Адсорбционная хроматография. В адсорбционном варианте жидкостной хроматографии различают нормально-фазовую (НФХ) и об- ращенно-фазовую (ОФХ) хроматографию. Традиционно принято считать, что в НФХ используют неполярную (малополярную) подвижную фазу и полярную неподвижную фазу (адсорбент). В ОФХ, наоборот, используется полярная подвижная фаза и неполярная неподвижная фаза. В ОФ адсорбционной хроматографии неполярным адсорбентом может быть графитированная сажа, кизельгур, диатомит, силикагель, химически модифицированный триметил- хлорсиланом ClSi(CH3)3. В качестве подвижной фазы используют сильнополярные растворители, такие как вода или вода с добавлением спиртов, ацетонитрила, а разделению подвергаются соединения с неполярными группами.

В нормально-фазовой адсорбционной хроматографии (НФ— ВЭЖХ) разделение осуществляется в результате взаимодействия вещества с полярным адсорбентом, как правило силикагелем или оксидом алюминия. На рис. 5.89 показана поверхность структуры силикагеля, содержащая различные активные группы.

Активные группы на поверхности силикагеля

Рис. 5.89. Активные группы на поверхности силикагеля:

1 — связанные водородной связью силанольные; 2 — свободные силанольные SiOH; 3 — силоксановые Si-0-Si

Источник: Евгеньев М.И., Евгеньева И.И., Герасимов М.К. Методы исследования свойств сырья и продуктов питания: Учеб, пособие. Казань: Изд-во ДАС, 2000. С. 17

Разделение смеси веществ на отдельные зоны при прохождении ее через хроматографическую колонку обусловлено различием в их способности к взаимодействию с адсорбционными центрами неподвижной фазы. В основе сорбции на поверхности адсорбента, имеющего в основном гидроксильные группы, лежат специфические взаимодействия между полярной поверхностью сорбента и полярными (или способными поляризоваться) группами и участками молекул.

К ним можно отнести образование водородной связи вплоть до образования л-комплексов или комплексов с переносом заряда. В отдельных случаях возможна хемосорбция, приводящая к образованию продуктов разложения или необратимой сорбции вещества.

Недостатки НФ—ВЭЖХ связаны со способностью полярной неподвижной фазы (силикагеля или оксида алюминия) удерживать на своей поверхности микроколичества воды. Алканы (гексан, гептан и другие растворители), используемые в качестве основных элюентов в НФ—ВЭЖХ, содержат небольшие количества воды (на уровне десятков ррт). Силикагель, находящийся в колонке в качестве сорбента, выступает как осушитель этих растворителей, меняя при этом свою активность, что приводит к изменению (плохой воспроизводимости) параметров удерживания разделяемых веществ (tr, Vr), а также селективности разделения. По этой причине НФ—ВЭЖХ на силикагеле (оксиде алюминия) была вытеснена распределительной ВЭЖХ.

Распределительная хроматография. Распределительный вариант хроматографии используется чаще, чем адсорбционный, ионообменный или эксклюзионный. Разделение веществ осуществляется на сорбентах с привитой фазой в обращенно-фазовом (ОФ) и нормально-фазовом (НФ) вариантах.

В распределительной ВЭЖХ разделение смеси на компоненты осуществляется за счет различия их коэффициентов распределения между двумя несмешивающимися фазами: растворителем (подвижная фаза) и привитой фазой на сорбенте (неподвижная фаза). При этом привитую на поверхность сорбента фазу можно воспринимать как пленку жидкости на носителе.

Основными привитыми фазами в НФ—ВЭЖХ являются нит- рильная и аминная фазы. Эти группы придают достаточно высокую полярность неподвижной фазе. Поэтому их можно использовать как в нормально-фазовом (элюирование неполярными растворителями), так и в обращенно-фазовом (элюирование полярными растворителями) вариантах. В качестве НФ-сорбентов они проявляют свойства, подобные силикагелю. Для них характерны те же элюотропные ряды растворителей, что и для силикагеля.

Вариант распределительной хроматографии, в котором используют сорбент с привитыми неполярными (например, алкильными) группами и в качестве элюента — полярный растворитель (например, смесь метанола и воды, ацетонитрила и воды), получил название обращенно-фазовой (ОФ) ВЭЖХ. Метод, использующий неполярную неподвижную фазу и полярную подвижную фазу, стал основным в ВЭЖХ в связи с тем, что в ОФ—ВЭЖХ используются растворители, пригодные для растворения практически всех важнейших групп химических веществ. Кроме того, перечисленные выше растворители удобны при использовании наиболее популярного в ВЭЖХ спектрофотометрического детектора.

Элюотропные ряды растворителей. Существует важное отличие механизма разделения веществ в газожидкостной хроматографии и ВЭЖХ. В ГЖХ взаимодействия веществ в подвижной (газовой, обычно гелий) фазе незначительны, поэтому селективность системы в основном определяется взаимодействиями разделяемых веществ с неподвижной фазой. В ВЭЖХ, напротив, подвижная (жидкая) фаза не является инертной к разделяемым веществам. Она может играть главную роль в процессе термодинамического распределения веществ между неподвижной и подвижной фазами из-за селективных взаимодействий компонентов анализируемой смеси с элюентом (смесью растворителей). По этой причине для эффективного разделения веществ в ВЭЖХ важную роль играет не только выбор сорбента, но и состав подвижной фазы.

Для оценки способности различных растворителей к вытеснению (элюированию) разделяемых веществ из колонки используется термин «элюотропные ряды». Элюотропный ряд — перечень растворителей в порядке возрастания их элюирующей способности.

Элюирующую способность растворителей часто характеризуют при помощи величины, называемой элюирующей силой (е°). Элюирующая сила растворителя показывает, во сколько раз энергия сорбции данного элюента больше, чем энергия сорбции элюента, выбранного в качестве стандарта, например н-гептана. Растворители (элюенты) делят на слабые и сильные. Слабые растворители слабо адсорбируются неподвижной фазой, поэтому коэффициенты распределения сорбируемых веществ (сорбата) высокие. Сильные растворители сильно адсорбируются, поэтому Кргсп низкие. Растворитель тем сильнее, чем выше растворимость в нем анализируемой пробы, чем сильнее взаимодействие растворитель — сорбат.

Поскольку элюирующая сила является мерой энергии взаимодействия молекул растворителя и неподвижной фазы, то, следовательно, зависит от природы сорбента. Поэтому элюирующая сила различна для каждой комбинации сорбент — подвижная фаза.

Элюирующая сила определяется полярностью растворителя. В нормально-фазовой хроматографии с увеличением полярности растворителя элюирующая сила растворителя растет, а в обращенно- фазовом варианте — снижается.

В жидкостной адсорбционной хроматографии для оксида алюминия элюотропный ряд имеет вид (в скобках приведены значения ?°): пентан (0) < н-гексан (0,01) < циклогексан (0,04) < СС14 (0,18) < бензол (0,32) < ацетон (0,51) < этанол (0,88) < вода, СН3СООН (очень большая).

Элюотропные ряды на обращенных (модифицированных) фазах обратны рядам на гидрофильной поверхности немодифицирован- ного силикагеля. В зависимости от типа привитой на силикагель фазы возможны изменения в последовательности ряда растворителей. В обращенно-фазовой хроматографии на сорбенте С18 элюотропный ряд имеет вид: метанол (1,0) < ацетонитрил (3,1), этанол (3,1) < изопропанол (8,3) сдиоксан (11,7).

Для разделения часто применяют не индивидуальные растворители, а их смеси. Незначительные добавки другого растворителя, особенно воды, существенно увеличивают элюирующую силу элю- ента.

В нормально-фазовой хроматографии, где полярность неподвижной фазы выше, чем подвижной, полярные вещества элюируются в последнюю очередь. При этом, чем менее полярна подвижная фаза, тем больше их времена удерживания. В обращенно-фазовой хроматографии полярные вещества элюируются первыми, а чем более полярна подвижная фаза, тем сильнее удерживаются неполярные вещества.

Общая схема действий при выборе хроматографических фаз такова. Сначала выбирают неподвижную фазу — такую, чтобы она была близка по полярности к разделяемым веществам. Затем подбирают подвижную фазу так, чтобы коэффициенты емкости находились в пределах от 2 до 5. При этом следует учитывать, что если полярности подвижной и неподвижной фаз близки, то времена удерживания оказываются слишком маленькими. Наоборот, если фазы сильно различаются по полярности, то времена удерживания будут слишком велики.

Ионообменная хроматография. В ионообменной ВЭЖХ (ИХ) разделение компонентов смеси достигается за счет обратимого взаимодействия веществ, способных к диссоциации с образованием ионов, с катионо- (анионо-) обменными группами сорбента (ионообмен- ника, ионита). Сохранение электронейтральности сорбента обеспечивается присутствием в растворе противоионов, способных к ионному обмену и находящихся в непосредственной близости от поверхности ионообменного сорбента. В зависимости от знака обменивающихся ионов иониты разделяются на катиониты, или катионообменники (между ионитом и раствором происходит обмен катионов), аниониты, или анионообменники (обмен анионов) и амфолиты, или амфолитные ионообменники (в зависимости от условий возможен обмен как катионов, так и анионов).

Среди ионообменников широкое распространение получили ионообменные смолы, содержащие полимерную часть R и ионогенные группы, например — или —NH^OH-. Группы —SOj и — NH3 —

фиксированные ионы, а противоионы Н+ и ОН- — подвижные и могут быть заменены другими ионами с зарядами того же знака.

Реакции ионного обмена записываются как обычные химические гетерогенные реакции:

Разделение смеси ионизированных веществ происходит в результате различия в их константах ионного обмена.

В целом удерживание в ИХ зависит от двух процессов. Первый из них связан с распределением образца между водной подвижной и органической неподвижной фазами. Вторым является процесс образования ионных пар (катионный и анионный обмен). Этот процесс является определяющим в удерживании веществ.

Экспериментально установлены ряды сродства или селективности ионов по отношению к ионообменникам. Так, при низких концентрациях раствора на сильнокислотных катионообменниках ионы с одинаковым зарядом сорбируются в такой последовательности:

Для ионов с различными зарядами сорбируемость увеличивается с увеличением заряда.

Для сильноосновных анионообменников сорбируемость ионов увеличивается в ряду

В качестве подвижной фазы в ИХ используют водные растворы солей, кислот, оснований, являющихся хорошо ионизирующими растворителями. Для повышения селективности варьируют условия разделения веществ подходящей подвижной фазы (концентрация, pH, ионная сила, состав).

К ионообменной хроматографии примыкает ионная хроматография. Это вариант ионообменной хроматографии, в которой на первой стадии проводят разделение смеси компонентов в разбавленном растворе кислоты (основания), а затем удаляют избыток кислоты (основания) в элюате для повышения чувствительности определения разделенных ионов кондуктометрическим детектором.

Составы типичных привитых неподвижных фаз, используемых в НФ, ОФ и ионной хроматографии, приведены на рис. 5.90.

Состав типичных фаз (привитых фаз), используемых в обращенно- фазовой, нормально-фазовой и ионообменной ВЭЖХ

Рис. 5.90. Состав типичных фаз (привитых фаз), используемых в обращенно- фазовой, нормально-фазовой и ионообменной ВЭЖХ

Источник: Евгеньев М.И., Евгеньева И.И., Герасимов М.К. Методы исследования свойств сырья и продуктов питания: Учеб, пособие. Казань: Изд-во ДАС, 2000. С. 19

Эксклюзионная хроматография. Другим вариантом ВЭЖХ, который используется для изучения молекулярно-массового распределения и определения белков, протеинов, других высокомолекулярных соединений, является эксклюзионная хроматография. Она основана на использовании в качестве неподвижной фазы пористого тела или геля. Разделение смеси веществ происходит в результате различия в размерах молекул веществ и/или их формы и способности проникать в поры неподвижной фазы. Принципиальной особенностью метода является возможность разделения и определения молекул по их размеру в диапазоне практически любых молекулярных масс — от 102 до 108 у.е.

По традиции процесс разделения, проводимый в органических растворителях, часто называют гелъ-проникающей хроматографией. Если же разделение проводят в водной системе, то метод называют гель-филътрационной хроматографией. Термин «эксклюзионная» более полно отражает механизм процесса разделения в этом методе, который заключается в исключении (разделении) молекул по их размеру (Size Exclusion).

Разделение в этом варианте ВЭЖХ происходит за счет распределения молекул между растворителем, находящимся внутри пор сорбента, и растворителем, протекающим между его частицами (рис. 5.91). Роль сорбента (твердого наполнителя колонки) заключается в формировании пор определенного размера. Неподвижной фазой является растворитель, заполняющий эти поры. Естественно, что применение термина «сорбент» к таким наполнителям в определенной степени условно.

Модель разделения молекул по размеру в эксклюзионной ВЭЖХ Источник

Рис. 5.91. Модель разделения молекул по размеру в эксклюзионной ВЭЖХ Источник: Евгеньев М.И., Евгвньвва И.И., Герасимов М.К. Методы исследования свойств сырья и продуктов питания: Учеб, пособие. Казань: Изд-во ДАС, 2000. С. 20

При эксклюзионном варианте ВЭЖХ все молекулы, размер которых больше размера пор сорбента, не могут в них попасть (происходит полная эксклюзия) и проходят по каналам между частицами. Они элюируются из колонки с одним и тем же объемом удерживания, равным объему удерживания подвижной фазы.

Молекулы с промежуточной молекулярной массой (размерами), способные проникать в поры определенного диаметра, удерживаются в колонке в соответствии с их размерами. Существенным отличием эксклюзионной хроматографии от других вариантов ВЭЖХ является то, что в ней разделение веществ заканчивается до выхода из колонки растворителя. В других вариантах ВЭЖХ компоненты смеси элюируются после растворителя. Связь между удерживаемым объемом VR и молекулярной массой (размером молекул) описывается градуировочной зависимостью (рис. 5.92).

Градуировочная зависимость, используемая в эксклюзионной хроматографии

Рис. 5.92. Градуировочная зависимость, используемая в эксклюзионной хроматографии

Источник: Евгеньев М.И., Евгеньева И.И., Герасимов М.К. Методы исследования свойств сырья и продуктов питания: Учеб, пособие. Казань: Изд-во ДАС, 2000. С. 20

Каждый сорбент характеризуется своей зависимостью, по которой можно оценить область разделяемых на нем молекулярных масс. Точка А на рисунке соответствует пределу эксклюзии, или мертвому объему колонки VQ (объем колонки, занимаемой подвижной фазой). Все молекулы, масса которых больше, чем соответствующие точке А, будут элюироваться одним пиком и иметь удерживаемый объем V. Точка В на рисунке отражает предел проникания колонки. Все молекулы, масса которых меньше, чем в точке В, также будут элюироваться из колонки одним пиком с удерживаемым объемом Vt Между точками А и В располагается диапазон селективного разделения. Соответствующий ему объем V. = Vf - VQ называют рабочим объемом колонки. Отрезок СД представляет собой линейный участок на градуировочной зависимости в координатах VR IgA/. Этот участок описывается уравнением

где Cj — отрезок, отсекаемый на оси ординат отрезком СД; С2 — тангенс угла наклона этого отрезка к оси ординат.

Достоинством эксклюзионной хроматографии является то, что метод характеризуется небольшими временами удерживания, определяемыми значениями коэффициентов распределения К (могут принимать значения между 0 и 1). Пики на гель-хроматограммах обычно достаточно узкие и хорошо воспроизводимые. Однако недостаток состоит в том, что ввиду ограниченности диапазона значений К максимальное число разрешенных пиков относительно невелико. Этим методом невозможно разделить молекулы одинакового размера, в частности изомеры. Считается, что разделение двух веществ будет удовлетворительным, если их молекулярные массы различаются не менее чем на 10%.

 
Посмотреть оригинал
Если Вы заметили ошибку в тексте выделите слово и нажмите Shift + Enter
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >
 

Популярные страницы