Меню
Главная
Авторизация/Регистрация
 
Главная arrow Медицина arrow Ветеринарная микробиология и иммунология

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ В БИОТЕХНОЛОГИИ

Генетическая инженерия — основа биотехнологии. Основным методом генетической инженерии по существу является генетическая рекомбинация, т. е. обмен генами между двумя хромосомами, которая приводит к возникновению клеток или организмов с двумя и более наследственными детерминантами (генами), по которым родители различались между собой. Метод рекомбинации заключается в следующем: выделение ДНК организмов или клеток из разных видов; получение гибридных молекул ДНК; введение рекомбинантных (гибридных) молекул в живые клетки; создание условий для экспрессии и секреции продуктов, кодируемых генами.

Гены, кодирующие те или иные структуры, выделяют (клонируют) из хромосом или плазмид, прицельно выщепляют из этих генетических образований при помощи ферментов рестрикции или синтезируют химически. Набор ферментов (известно более 500 рестриктаз), способных резать ДНК по определенным связям (сайтам), является важным инструментом генетической инженерии. В последнее время обнаружены ферменты, расщепляющие по определенным связям РНК наподобие рестрикции ДНК. Эти ферменты названы рибозимами. Их роль еще пока не выяснена.

При помощи химического синтеза могут быть получены сравнительно небольшие гены. Для этого вначале расшифровывают число и последовательность аминокислот в белковой молекуле вещества и по этим данным узнают очередность нуклеотидов в гене, поскольку каждой аминокислоте соответствуют три нуклеотида (кодон). При помощи синтезатора химическим путем создают ген, аналогичный природному гену.

Полученный целевой ген при помощи ферментов лигаз сшивают с другим геном, который используется в качестве вектора для встраивания гибридного гена в клетку. В качестве вектора могут служить плазмиды, бактериофаги, вирусы человека, животных и растений.

Число плазмид в бактериальной клетке может колебаться от одной до нескольких сотен, причем чем большие размеры имеет плазмида, тем меньше ее копий в клетке. Путем ампфликации генов, т. е. увеличения числа копий определенного гена в клетке, можно резко повысить производство кодируемого клеткой вещества. Ампфликацией удается добиться получения до 3000 копий плазмидных генов на клетку.

Бактериофаг как вектор используют аналогично. Целевой ген встраивают в геном фага, и он реплицируется вместе с генами вируса при размножении последнего в бактериальной клетке. Чаще всего используют фаг X, который содержит ДНК, состоящую из 50 тыс. пар нуклеотидов. Преимущество фага X перед плазмидами в том, что фаговый вектор позволяет клонировать большие фрагменты чужеродной ДНК.

В случае использования в качестве векторов вирусов человека, животных и растений чужеродный ген встраивают в ДНК вируса, и он реплицируется вместе с размножением последнего в клетке. Применяют в качестве вектора космиды, представляющие собой гибрид плазмиды с фагом. Космиды используют для клонирования больших (до 45 тыс. пар нуклеотидов) фрагментов ДНК эукариот.

Для РНК-содержащих вирусов передача генетической информации возможна с помощью ревертазы (обратной транскриптазы), передающей информацию о структуре белка от РНК к ДНК, которая является комплементарной иРНК.

На рис. 39 показана принципиальная схема получения рекомбинантных молекул ДНК и рекомбинантных бактерий. Экспрессируемый ген в виде рекомбинантной ДНК (плазмида, фаг, кос- мида, вирусная ДНК) встраивают в бактериальную или животную клетку, которая приобретает новое свойство — способность продуцировать не свойственное этой клетке вещество, кодируемое экспрессируемым геном. Для лучшего проникновения вектора через стенку бактерий иногда прибегают к воздействию на стенку (например, хлоридом кальция), чтобы увеличить ее проницаемость.

Схема получения рекомбинантных ДНК и рекомбинантных штаммов микроорганизмов

Рис. 39. Схема получения рекомбинантных ДНК и рекомбинантных штаммов микроорганизмов

В качестве реципиентов экспрессируемого гена чаще всего используют Е. coli, В. subtilis, псевдомонады, дрожжи, вирусы. Реципиента подбирают не только с учетом возможности встройки чужеродного гена, но и уровня выраженности (экспрессии) синтеза вещества, кодируемого геном; возможности его секреции в окружающую среду; легкости и доступности массового культивирования; экологической безопасности. Некоторые штаммы рекомбинантных бактерий способны переключать на синтез чужеродного вещества, экспрессируемого геном, до 50 % своего синтетического потенциала. Такие штаммы —суперпродуценты целевых продуктов — уже получены и применяются в биотехнологической промышленности; они носят название промышленных штаммов. В качестве примера можно привести штаммы — суперпродуценты интерферона, интерлейкина, белков ВИЧ и др.

Некоторые штаммы микроорганизмов хорошо экспрессируют чужеродные гены, но плохо секретируют продукт в окружающую среду. В таких случаях приходится применять дезинтеграцию (разрушение) клетки с целью высвобождения из нее синтезированного продукта.

В некоторых случаях, несмотря на наличие экспрессии и секреции, продукт не удается получить, вернее собрать, из-за разрушения в процессе синтеза или после него протеазами и другими ингибиторами. Это прежде всего относится к низкомолекулярным пептидам.

С целью повышения уровня секреции целевого белка пользуются следующим приемом: к гену целевого белка присоединяют ген белка, хорошо секретируемого клеткой реципиента. Образующийся в результате такой манипуляции химерный белок, хорошо секретируемый клеткой, собирают и от него отщепляют целевой белок. Возможно также к гену целевого белка присоединить ген- индикатор, т. е. ген, кодирующий легко узнаваемый белок, в результате чего получают химерный индикаторный белок, а из него —целевой белок. В качестве индикатора можно использовать, например галактозидазу.

 
Посмотреть оригинал
Если Вы заметили ошибку в тексте выделите слово и нажмите Shift + Enter
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >
 

Популярные страницы