СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ОЖКЗ ТЕЛЯТ, ВЫЗВАННЫХ ПАТОГЕННЫМИ И УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ

В последние годы наблюдается увеличение удельного веса инфекционных заболеваний, вызванных ассоциациями микроорганизмов. Эти инфекции характеризуют выраженным клиническим полиморфизмом, связанным с одновременным воздействием нескольких агентов, что затрудняет интерпретацию результатов лабораторных исследований, поскольку каждая из составляющих микст-культур обладает рядом характеристик, сочетание которых может определять патогенный потенциал возбудителей в целом.

Установлено, что смешанный характер заболеваний, вызванных различными возбудителями, препятствует выявлению основного этиологического агента, вызывающего инфекционный процесс, и затрудняет проведение этиотропной противоинфекционной терапии. Также далеко не полностью расшифрована структура самих микробных ассоциаций, не в полной мере выявлена роль некоторых составляющих ее микроорганизмов в их прямом или опосредованном влиянии на организм животных.

В то же время межбактериальные взаимодействия как один из механизмов формирования ассоциаций микроорганизмов и изменения в проявлении патогенных свойств условно-патогенных микроорганизмов изучены недостаточно в связи с несовершенством методов их диагностики.

Традиционно применяемые таксономические методы идентификации патогенных микроорганизмов основаны на использовании различных хемотаксономических тестов, таких как выявление специфической ферментативной активности, способности метаболизи- ровать сахара или поддерживать рост на средах с селективными добавками.

Сложность стандартизации условий подобных тестов, а также естественная фенотипическая вариабельность, присущая многим микроорганизмам, могут быть причиной неправильной идентификации.

В связи с тем, что в значительной мере бактериологи продолжают зависеть от морфологических и биохимических критериев при идентификации микроорганизмов, выделяемых из патологического материала и объектов окружающей среды, в некоторых случаях идентификация и классификация патогенных микроорганизмов не отвечает запросам ветеринарной практики. Обусловлено это наличием ряда обстоятельств, среди которых основными являются следующие: неудовлетворительная экспрессия фенотипических признаков, прежде всего, факторов патогенности у бактерий в различных условиях их культивирования; существование некуль- тивируемых бактерий; способность более чем 20 видов патогенных бактерий переходить в состояние покоя, характеризующееся резко сниженной метаболической активностью и временной потерей способности к размножению; наличие генетического механизма, осуществляющего постоянное изменение антигенных детерминант в организме-хозяине, что, с одной стороны, помогает возбудителю выживать в макроорганизме, уходя от воздействия иммунного ответа организма-хозяина, а с другой, приводит к неудачам лабораторной диагностики при использовании сероиммунологических методов.

В подобных случаях идентифицировать и классифицировать такие формы патогенных бактерий, используя общепринятые в ветеринарных лабораториях хемотаксономические признаки, невозможно.

Следует признать, что в лабораторной практике также существуют естественные ограничения при использовании фенотипических методов оценки лекарственной устойчивости возбудителей ассоциированных инфекций.

Диско-диффузный метод определения чувствительности к про- тивомикробным препаратам является доминирующим в практической деятельности ветеринарных лабораторий РФ.

Его основное достоинство — простота в исполнении и экономическая доступность. В силу упомянутых причин он до настоящего времени остается предпочтительным для большинства лабораторий.

Вместе с тем очевидны его взаимообусловленные недостатки: диско-диффузный метод используют при определении чувствительности к антибиотикам ограниченного числа микроорганизмов; метод не пригоден, если микроб не образует на поверхности агаризиро- ванной питательной среды, гомогенный газон определенной плотности или если газон образуется только после длительной инкубации более 24 часов у бактерий и более 48 у грибов; для реализации метода пригоден узкий круг питательных сред, зачастую не предназначенных для роста требовательных микроорганизмов; зона подавления роста микроба не всегда адекватна его истинной чувствительности к противомикробным средствам и т.д.

Кроме того, результаты хемотаксономических тестов могут быть искажены в связи со снижением активности антимикробных препаратов в процессе длительного культивирования микроорганизмов и не могут служить основанием для оценки чувствительности микроорганизмов к противомикробным препаратам.

Из представленных примеров следует, что в арсенале современных бактериологических лабораторий ферм должны быть методы, позволяющие идентифицировать, классифицировать и дифференцировать патогенные микроорганизмы независимо от формы или состояния, в котором они находятся в макроорганизме или объектах окружающей среды.

Помимо традиционных способов определения видовой принадлежности возбудителей ассоциированных инфекций, должно уделяться внимание их геномным характеристикам. Это особенно важно для определения микроорганизмов, которые претерпевают адаптивные изменения под воздействием неблагоприятных экологических факторов, антибактериальной терапии, при контакте с больным животным. Для проведения полимеразной цепной реакции в ветеринарных центрах РФ организация лаборатории при использовании метода ПЦР в реальном времени (рис. 8), а также в классическом варианте (рис. 7).

При ассоциированных инфекциях инфицирующие дозы имеют низкие значения, поэтому первоочередной задачей является разработка таких методов индикации микроорганизмов, которые могли бы сочетать быстроту, специфичность, обладать функцией мульти-

Организация ПЦР-лаборатории

Рис. 7. Организация ПЦР-лаборатории

Организация лаборатории при использовании метода ПЦР в реальном

Рис. 8. Организация лаборатории при использовании метода ПЦР в реальном

времени

плексности соответствовать современному уровню развития лабораторного дела.

Принцип постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР). Методы индикации, основанные на структурных особенностях нуклеиновых кислот, в частности метод ПЦР, в настоящее время являются самыми чувствительными и высокоспецифичными методами анализа микроорганизмов. Установлено, что ПЦР и секвенирование чувствительности и специфичности превосходят все существующие до настоящего времени хемотаксономические методы, поскольку выявляют гены (нуклеиновые кислоты) возбудителей, а не антигены и антитела.

Применение ПЦР для выявления источника возникновения очага инфекции, выделение и изучение возбудителей инфекционных болезней (ассоциированных инфекций) как в течение эпизоотии, так и в межэпизоотический период позволят следить за изменением генетической структуры микроорганизмов, предсказывать появление новых вариантов и создавать адекватные средства защиты и диагностические препараты. Помимо этого ПЦР-диагностика позволяет определять наличие возбудителя в период так называемого «серологического окна», т.е. в промежуток времени между моментом инфицирования организма и временем появления антител в количествах, достаточных для определения.

В основе метода ПЦР лежит комплементарное достраивание ДНК-матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента ДНК- полимеразы (рис. 9). Эта реакция носит название репликации ДНК.

Образование цепи ДНК

Рис. 9. Образование цепи ДНК

Естественная репликация протекает в несколько стадий: 1) денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, расхождения нитей ДНК); 2) образование коротких двунитевых участков ДНК («затравок», необходимых для начала синтеза ДНК); 3) синтез новой цепи ДНК (комплементарно, для получения копий коротких участков ДНК, специфичных, например, для конкретных микроорганизмов, т.е. происходит целенаправленный поиск таких специфических участков, что и служит целью генетической диагностики для выявления возбудителей инфекционных заболеваний).

Открытие термостабильной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы (Taq-полимеразы) из термофильных бактерий Thermus aquaticus с оптимумом реакции при температуре 70—72°С позволило сделать процесс репликации ДНК циклическим.

Предпосылками для широкого внедрения метода ПЦР в практику клинико-диагностических лабораторий послужили разработка и промышленный выпуск термостатов с циклической сменой температуры по заданной программе (амплификаторов) и автоматизация этого процесса (рис. 10).

При многократном повторении циклов синтеза происходит экспоненциальное (в геометрической прогрессии) увеличение количества копий специфического фрагмента ДНК. Часто искомая ДНК не присутствует в исследуемом материале в достаточном количестве

Программируемые термостаты (амплификаторы)

Рис. 10. Программируемые термостаты (амплификаторы)

для генетических исследований или определения микроорганизмов. Поэтому для увеличения аналитической чувствительности искомая ДНК должна быть размножена. Полимеразная цепная реакция — наиболее подходящий метод для этих целей.

Таким образом, по своему принципу ПЦР — метод многократно повторяющихся циклов ферментативного синтеза in vitro специфических нуклеотидных последовательностей ДНК-матрицы, катализируемого ферментом ДНК-зависимой ДНК-полимеразой (амплификация).

Многократно копируемый участок ДНК заведомо выбран исследователем из известной нуклеотидной последовательности определенного фрагмента ДНК-матрицы, который является маркерным, т.е. специфическим, уникальным, например, для данного вида возбудителя. С внедрением этого метода отпала необходимость выделять и очищать ДНК-мишень. Очень небольшой по объему и необработанный материал может быть исследован и подвергнут детекции. Комплементарное достраивание цепи ДНК начинается не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках — коротких двунитевых участках. В случае присоединения таких блоков к специфическим участкам ДНК можно направить процесс синтеза новой цепи только в этом участке, а не по всей длине цепи ДНК.

Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две олигонуклеотидные «затравки», содержащие 18—35 нуклеотидов, которые комплементарны последовательностям ДНК на правой и левой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК происходит только между ними.

Каждый цикл амплификации при полимеразной цепной реакции протекает в присутствии следующих основных компонентов: ДНК- матрица (ДНК или ее часть, содержащая искомый специфический фрагмент ДНК в образце любого происхождения, в частности, в любой биожидкости); два синтетических олигонуклеотидных праймера, комплементарные участкам ДНК, находящимся на противоположных нитях на границах определяемого специфического фрагмента и фланкирующим искомую мишенную последовательность ДНК; четыре дезоксирибонуклеотида (дНТФ) — смесь дезоксирибо- аденозинтрифосфата, дезоксирибоцитидинтрифосфата, дезоксири- богуанозинтрифосфата, дезоксириботимидинтрифосфата, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК; термостабильная ДНК-зависимая ДНК-полимераза, выдерживающая нагревание до 95°С, катализирующая удлинение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований из смеси дезоксирибонуклеотидов к растущей цепи синтезируемой ДНК; соответствующий солевой буфер, реакционная среда с обязательным присутствием ионов магния, необходимых для поддержания активности ДНК-зависимой ДНК-полимеразы.

Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играют важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа.

Конструирование праймеров проводят после определения нуклеотидных последовательностей в исследуемой ДНК. Для подбора оптимальных условий полимеразной цепной реакции с выбранными праймерами используют специальные компьютерные программы. Для анализа сходства испытуемых ДНК с известными нуклеотидными последовательностями используют международные банки данных и компьютерные программы.

Для определения специфических участков генома РНК-содер- жащих вирусов сначала получают ДНК-копию с РНК-матрицы, используя реакцию обратной транскрипции, катализируемую ферментом ревертазой (обратной транскриптазой).

Для получения достаточного количества копий искомого специфического фрагмента амплификация ДНК должна включать несколько (20—40) циклов. Каждый цикл ПЦР состоит из трех этапов (фаз), протекающих при различных температурных режимах. Продолжительность каждого этапа зависит от конкретного определяемого аналита, используемого набора реактивов и типа амплифика- тора.

Если для выявления нуклеиновой кислоты-мишени методом гибридизации in situ с применением радиоактивного меченого зонда необходимо, чтобы мишень присутствовала в препарате в нескольких тысячах копий, то при ПЦР интересующая последовательность может быть первоначально представлена лишь одной молекулой. По окончании первого цикла ПЦР из одной молекулы ДНК образуются две новые, идентичные оригинальной. Поскольку праймеры гибри- дизуются с обеими цепями ДНК, то и нативная последовательность, и синтезируемые ПЦР-продукты могут служить матрицами в последующих циклах репликации. В результате число копий уникальной последовательности увеличивается экспоненциально. Благодаря этой последовательности присутствующие в изучаемом материале в минимальном количестве одна или несколько копий и не поддающиеся обнаружению никакими другими методами легко выявляются с помощью ПЦР.

Таким образом, ПЦР позволяет найти «иголку в стоге сена», например, при исследовании клеток — всего одну аномальную последовательность на 100 000—1 000 000 клеток. Экспоненциальное увеличение числа копий молекулы-мишени не только обеспечивает высокую чувствительность, но и облегчает их выявление.

Образование цепей ДНК

Рис. 11. Образование цепей ДНК

  • 1- й этап — денатурация ДНК (расплетение двойной цепи), протекает при температуре 93—95°С в течение 30—40 с.
  • 2- й этап — присоединение праймеров (отжиг), происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных однонитевых цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига в интервале 50—65 °С. Продолжительность отжига — 20—60 с.
  • 3- й этап — элонгация — комплементарное достраивание цепей ДНК, происходит от 5-го конца к 3-му концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат, как указано ранее, дНТФ. Процесс синтеза происходит при температуре 70—72°С. Продолжительность этапа — 20—40 с.

Увеличение числа копий ДНК носит экспоненциальный характер только в первых 20—25 циклах, в дальнейшем в результате истощения дНТФ, снижения активности 7я<7-ДНК-полимеразы и по другим причинам увеличение количества образующихся копий прекращается.

Итак, схема ПЦР-диагностики выглядит следующим образом:

  • • взятие биоматериала для исследования;
  • • пробоподготовка (выделение нуклеиновых кислот) (рис. 12);
  • • постановка и проведение собственно ПЦР;
  • • детекция ампликонов (электрофорез в геле, планшетная гибридизация);
  • • интерпретация результатов.
 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >