Меню
Главная
Авторизация/Регистрация
 
Главная arrow Агропромышленность arrow Неонатология и болезни новорожденных телят

Определение концентрации иммуноглобулинов основных классов методом радиальной иммунодиффузии по Манчини.

Для определения концентрации иммуноглобулинов основных классов (IgG, IgM, IgA) используют метод радиальной иммунодиффузии в агаровом геле по Манчини. Принцип метода заключается в способности молекул иммуноглобулина испытуемых сывороток, помещенных в лунки агарового геля, радиально диффундировать и образовывать преципитиру- ющие иммунные комплексы с комплементарными молекулами специфической антисыворотки, содержащиеся в жидкой фазе агара. Количественная оценка основана на том, что размеры полученных колец преципитации прямо пропорциональны количеству иммуноглобулинов в лунках (при равных объемах препаратов в лунках) и обратно пропорциональны концентрации антисыворотки в агаре. По квадрату диаметра колец преципитации можно судить о соотношении концентраций иммуноглобулинов в лунках при сокращенном времени инкубации (IgG, IgA — 24 ч, IgM — 48 ч).

В качестве оборудования и материалов используем водяную баню; столик с уровнем; стеклянные пластины (6x9 см); перфоратор для геля диаметром 1,5 мм; вакуумный насос с наконечником; трафарет лунок; калиброванные пипетки с тонкими наконечниками (объем 1 мкл); штангенциркуль для. измерения диаметров колец преципитации; кюветы с покровным стеклом для хранения гелей во влажной камере; конические колбы для приготовления раствора агара; градуированные пипетки с грушей (1—5 мл); пробирки (5 мл) для смешивания гелей с моноспецифической сывороткой; агар Дифко; фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ, pH-7,2); Na2HPOi х 12Н20 — 2,7 г; NaH2P04 х 2Н20 — 0,39 г; NaCL — 9,0 г на 1 л дистиллированной воды; стандартные растворы моноспецифических антисывороток к иммуноглобулинам (IgG, IgM, IgA) птиц; стандартная сыворотка крови кур с известным содержанием в ней иммуноглобулинов каждого класса.

Постановка реакции осуществляют в несколько этапов:

  • • расплавляют 2,5%-ный агар Дифко на ФСБ, а затем помещают колбу с агаром в водяную баню при 56°С;
  • • подогревают в бане несколько стеклянных пробирок (5 мл) для смешивания гелей с моноспецифической антисывороткой;
  • • вносят в пробирку 10%-ное рабочее разведение антисыворотки IgG (IgM, IgA) в агаре Дифко при 56°С: 0,5 мл стандартного разведения антисыворотки в ФСБ (1 мл буфера на 1 ампулу ); 2 мл ФСБ; 2,5 мл 2,5%-ного расплавленного агара Дифко. Данная концентрация подобрана таким образом, чтобы диаметры колец преципитации по завершении реакции были порядка 1 см. Чувствительность реакции можно увеличить, снижая концентрацию антисыворотки в агаре. При этом образуются более бледные диски большего диаметра, что, соответственно, приводит к уменьшению количества образцов на пластине. Для каждой пластины готовят отдельную пробирку с разведением антисыворотки в агаре;
  • • пробирку закрывают пробкой и несколько раз осторожно быстро переворачивают, чтобы тщательно перемешать агар с реагентом. Не допускают образования пузырей;
  • • подогретую стеклянную пластину 6 х 9 см помещают на горизонтальный столик и быстро выливают на нее смесь агара с реагентом (5 мл), равномерно распределяя жидкость по всей поверхности пластины;
  • • после затвердевания геля пластину помещают во влажную кювету. Пластины следует подготавливать за 24 ч до эксперимента и хранить при 4°С для равномерного распределения внесенного в гель реагента. Для увеличения срока хранения пластины можно добавить в агар несколько мг азида натрия;
  • • по трафарету в застывшем агаре вырезают 25 лунок диаметром 1,5 мм (объем 2 мкл) с помощь перфоратора. Удаляют вырезанные кусочки геля вакуумным насосом;
  • • испытуемые пробы сыворотки крови вносят в лунки в объеме 1 мкл. Для каждого образца используют отдельные наконечники. Кроме того, в лунки каждой пластины вносят серию разведений стандартной сыворотки, чтобы сравнивать с ними опытные образцы. Сравнение результатов разведений стандартной сыворотки на одной пластине с опытными образцами на другой может исказить результаты, так как пластины между собой имеют отличия;
  • • стеклянную пластину помещают во влажную камеру и оставляют на 24 ч для учета реакции по определению IgG (IgA) и на 48 ч по определению IgM. Гели инкубируют при комнатной температуре. Необходимо исключить резкие перепады температур, поскольку это может привести к появлению нескольких колец преципитации в системе с одной антисывороткой.

Оценку результатов реакции проводят, измеряя диаметр колец преципитации с помощью штангенциркуля по тыльной стороне пластины с влажным гелем, просматривая его при косом освещении. Кроме того, прежде чем измерять кольца преципитации, необходимо высушить и окрасить пластины.

Уровень иммуноглобулинов определяют по калибровочной кривой, откладывая по оси абсцисс известную концентрацию иммуноглобулинов (мг/мл), содержащуюся в стандартной сыворотке каждого разведения, а по оси ординат — квадрат диаметра колец преципитации разведений стандартной сыворотки. Соединяя точки, получают калибровочную кривую. Для каждой пластины строят отдельную калибровочную кривую.

Для определения концентрации иммуноглобулинов в испытуемых образцах по оси ординат откладывают квадраты диаметров колец преципитации, восстанавливают перпендикуляр до пересечения с калибровочной кривой и точку пересечения проектируют на ось абсцисс. Полученное значение соответствует концентрации иммуноглобулинов, выраженной в мг/мл.

 
Посмотреть оригинал
Если Вы заметили ошибку в тексте выделите слово и нажмите Shift + Enter
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >
 

Популярные страницы